發(fā)布時間：2020-08-14 22:11

【摘要】：目的:1.探究在靜壓力作用下,不同作用時間點的人牙齦成纖維細(xì)胞(HGFs)表達(dá)鈣網(wǎng)蛋白(CRT)及轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)的情況。2.探究shRNA基因沉默HGFs中CRT的表達(dá)后,HGFs中TGF-β1的表達(dá)變化情況,分析CRT對HGFs中TGF-β1表達(dá)的影響,以初步研究CRT在人牙齦纖維化轉(zhuǎn)導(dǎo)信號通路中的作用機(jī)制。方法:1.組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)出原代HGFs,經(jīng)傳代純化后,取第4-6代HGFs接種在聚乳酸-乙醇酸聚合物(PLGA)支架上,建立HGFs-PLGA支架復(fù)合培養(yǎng)模型從而構(gòu)建三維培養(yǎng)模式。2、采用重物加載法對已構(gòu)建成功的復(fù)合培養(yǎng)模型加載25g/cm~2的力,按加力時間分為0h,6h,24h,48h,72h組,對照組為0h(未加力)組。通過實時熒光定量PCR技術(shù)(RT-qPCR)檢測各加力組CRT、TGF-β1的基因相對于未加力組的表達(dá)情況,通過蛋白免疫印跡法(Western Blot)檢測各加力組CRT、TGF-β1的蛋白相對于未加力組的表達(dá)量。3.構(gòu)建重組腺病毒rAdE5-CRT1p2-shRNA,用重組腺病毒轉(zhuǎn)染第4代的HGFs,以沉默HGFs中CRT的表達(dá),CCK-8法檢測腺病毒轉(zhuǎn)染對HGFs增殖能力的影響。轉(zhuǎn)染72h后,使用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞內(nèi)綠色熒光蛋白表達(dá)量,并計算轉(zhuǎn)染效率;并采用RT-qPCR、Western Blot技術(shù)檢測基因沉默效率。4.采用RT-qPCR、Western Blot技術(shù)檢測沉默HGFs中CRT的表達(dá)后,TGF-β1的mRNA及蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果:1.組織塊培養(yǎng)法成功培養(yǎng)出原代HGFs,傳代順利,并完成HGFs-PLGA支架復(fù)合培養(yǎng)模型的構(gòu)建。2.隨著加力時間的延長,HGFs中CRT、TGF-β1的基因和蛋白的表達(dá)量升高,在24h升到最高,隨后逐漸降低。3.轉(zhuǎn)染72h后,沉默組轉(zhuǎn)染效率達(dá)到88.101±0.058%,陰性對照組轉(zhuǎn)染效率達(dá)到88.359±0.022%。4、CCK-8結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染組、空白對照組的OD值均隨培養(yǎng)時間的延長呈上升的趨勢;比較相同天數(shù)轉(zhuǎn)染組與空白組的OD值,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。5、Ad-shRNA組HGFs中CRT、TGF-β1的mRNA和蛋白表達(dá)量較空白對照組明顯下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論:1.靜壓力可促進(jìn)HGFs中CRT、TGF-β1的表達(dá),隨著加力時間的延長,兩者的表達(dá)水平均增高,到達(dá)峰值后下降。2.CRT對HGFs中TGF-β1的生成有重要作用。
【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R783.5
【圖文】：

圖 1-1 HGFs 三維培養(yǎng)重物加載模型Fig1-1 The modified “weight” method for loading compressive force結(jié)果置顯微鏡觀察，約 5-15 天可見組織塊周邊有少量細(xì)胞

HGFs 原代培養(yǎng) 40× HGFs 傳代培養(yǎng) 40×圖 1-2 HGFs 的培養(yǎng)Fig1-2 The culture of human gingival fibroblasts

25圖 2-2 靜壓力對 HGFsTGF-β1 mRNA 表達(dá)的影響2 The mRNA expression of TGF-β1 HGFs under compress表示與 0 h 比較，P＜0.05 差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前6條

1 葉健文;周闖;閻冰;楊佳;傅哲;唐文超;翟文龍;;鈣網(wǎng)蛋白基因沉默對人肝癌細(xì)胞的增殖及侵襲能力的影響[J];中華肝膽外科雜志;2015年06期

2 鄭怡;yだ

本文編號：2793606