【摘要】：背景和目的上皮根鞘(Hertwig's epithelial root sheath,HERS)作為啟動(dòng)牙根的信號(hào)中心,在牙根發(fā)育中必不可少。牙根的正常生理過(guò)程與HERS完整的形成、適時(shí)的斷裂及細(xì)胞增殖、凋亡密切相關(guān)。牙本質(zhì)發(fā)育不良I型(Dentin dysplasia type I,DD-I)又稱為根部牙本質(zhì)發(fā)育不良,是一種牙根嚴(yán)重發(fā)育不良導(dǎo)致根短小、畸形的常染色體顯性遺傳病。細(xì)胞液泡分選蛋白4B(Vacuolar protein sorting 4B,VPS4B)是一種多功能蛋白,在調(diào)控細(xì)胞增殖凋亡、溶酶體降解、細(xì)胞內(nèi)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)等過(guò)程中起重要作用。本課題組前期對(duì)一個(gè)DD-I家系外周血全基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)該家系致病基因?yàn)閂PS4B;并且研究表明VPS4B可能是影響牙齒發(fā)育的重要基因,但是其在牙根發(fā)育過(guò)程中的具體作用不是很清楚。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)Vps4b基因敲除小鼠模型,觀察HERS在牙根發(fā)育過(guò)程中的形態(tài)變化,分析該基因突變對(duì)HERS細(xì)胞增殖、凋亡能力的影響,進(jìn)而探討該基因在牙根致畸中的可能作用。材料與方法將Vps4b基因敲除小鼠雌雄合籠交配,記錄出生后(Postnatal,P)時(shí)間。分別于P5天、P9天、P11天、P15天、P19天引頸處死解剖分離下頜第一磨牙區(qū)下頜骨和小鼠尾巴。新生幼鼠的基因型使用PCR技術(shù)進(jìn)行鑒定。將幼鼠下頜骨采用4%多聚甲醛溶液固定、10%EDTA脫鈣、石蠟包埋,制備切片,使用蘇木精-伊紅(Haematoxylin and eosin,HE)染色的方法確定各組小鼠牙根發(fā)育時(shí)期,免疫組織化學(xué)方法對(duì)不同時(shí)期HERS細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞角蛋白14(Cytokeratin14,CK14)、增殖細(xì)胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)以及B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)進(jìn)行組織定位,對(duì)比野生小鼠和Vps4b基因敲除小鼠CK14、PCNA、Bcl-2蛋白表達(dá)的差異。結(jié)果PCR的檢測(cè)結(jié)果顯示子代小鼠基因型為正常型Vps4b~(+/+)和雜合型Vps4b~(+/-)兩種。正常小鼠HE染色顯示:小鼠P5天HERS形成,牙根發(fā)育開(kāi)始;P9天HERS結(jié)構(gòu)連續(xù),根分叉結(jié)構(gòu)形成;P11天HERS發(fā)生斷裂;P15天根1/3開(kāi)始形成;P19天牙根發(fā)達(dá)到生理性長(zhǎng)度,HERS繼續(xù)斷裂,其末端保持完整。正常小鼠免疫組織化學(xué)染色結(jié)果:P5天,HERS形成雙層細(xì)胞結(jié)構(gòu),HERS細(xì)胞PCNA陽(yáng)性表達(dá),Bcl-2無(wú)表達(dá);P9天,HERS仍連續(xù)并繼續(xù)延伸,HERS細(xì)胞PCNA強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá),Bcl-2陽(yáng)性表達(dá);P11天,HERS開(kāi)始發(fā)生斷裂,HERS末端保持完整,牙頸部有少量細(xì)胞PCNA陽(yáng)性表達(dá),HERS末端部分PCNA強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá),Bcl-2在HERS細(xì)胞中弱陽(yáng)性表達(dá);P15天,牙根表面很少見(jiàn)到PCNA陽(yáng)性的HERS細(xì)胞,HERS末端PCNA仍強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá),HERS細(xì)胞Bcl-2弱陽(yáng)性表達(dá);P19天,牙根發(fā)育基本完成,僅HERS末端PCNA陽(yáng)性表達(dá),Bcl-2陰性表達(dá)。Vps4b基因敲除后抗CK14蛋白顯示HERS在P9天開(kāi)始發(fā)生斷裂,P15天以后HERS不連續(xù),HERS細(xì)胞數(shù)量減少,并形成細(xì)胞簇附著在牙根表面;與正常小鼠相比,PCNA在HERS細(xì)胞中表達(dá)強(qiáng)度變?nèi)?P0.05),HERS細(xì)胞僅在P9天、P11天Bcl-2呈陽(yáng)性表達(dá)并且表達(dá)強(qiáng)度減弱(P0.05)。結(jié)論在Vps4b~(+/-)小鼠牙根發(fā)育過(guò)程中HERS的連續(xù)性過(guò)早中斷,提示Vps4b基因的缺失影響HERS正常形態(tài)的形成。HERS細(xì)胞PCNA、Bcl-2的表達(dá)強(qiáng)度減弱,推測(cè)Vps4b可能通過(guò)調(diào)節(jié)HERS細(xì)胞的增殖、凋亡進(jìn)而影響牙根的發(fā)育。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R78
【圖文】：

可擴(kuò)增出一條 425bp條帶，隱性純合型無(wú)條帶（如圖 4.1）。圖4.1 小鼠Vps4b gDNA擴(kuò)增結(jié)果圖：A. 以F1/R1為引物擴(kuò)增出2條條帶；B. 以 F1/R2 為引物擴(kuò)增一條條帶

圖 5.2-1 各期牙根 HE 染色：A:P5 HERS 開(kāi)始形成；B：P9 根分叉開(kāi)始；C：P11 HERS開(kāi)始斷裂；D：P15，根 1/3 形成；E：P19 牙根基本發(fā)育完成。HERS：上皮根鞘；Am:成釉細(xì)胞；DP：牙乳頭；DF：牙囊；Fur:根分叉結(jié)構(gòu)。×40

圖 5.2-1 各期牙根 HE 染色：A:P5 HERS 開(kāi)始形成；B：P9 根分叉開(kāi)始；C：P11 HERS開(kāi)始斷裂；D：P15，根 1/3 形成；E：P19 牙根基本發(fā)育完成。HERS：上皮根鞘；Am:成釉細(xì)胞；DP：牙乳頭；DF：牙囊；Fur:根分叉結(jié)構(gòu)。×40

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 蓋立婷;徐高祥;姜秋;;影響牙根發(fā)育因素的研究進(jìn)展[J];口腔醫(yī)學(xué)研究;2015年05期

2 王文光;;不同牙根發(fā)育階段與正畸治療中牙根吸收關(guān)系的臨床研究[J];中國(guó)當(dāng)代醫(yī)藥;2011年28期

3 葉楠;文玲英;金巖;方軍;楊富生;衛(wèi)克文;金明;軒昆;陳嶸;;先天性牙根發(fā)育不良致病相關(guān)基因的篩選[J];臨床口腔醫(yī)學(xué)雜志;2009年06期

4 文玲英;金巖;;牙根發(fā)育不良疾病及其研究[J];實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志;2007年02期

5 軒昆;文玲英;金巖;楊富生;樊淑梅;;3例中國(guó)牙根發(fā)育不良患兒的臨床、實(shí)驗(yàn)室檢查及分析[J];牙體牙髓牙周病學(xué)雜志;2007年06期

6 軒昆;金鈁;金巖;楊富生;樊淑梅;文玲英;;1例先天性牙根發(fā)育不良患兒致病基因的篩選及突變分析[J];臨床口腔醫(yī)學(xué)雜志;2007年11期

7 軒昆;文玲英;金巖;楊富生;石利強(qiáng);樊淑梅;;3例牙根發(fā)育不良患兒牙齒的病理學(xué)評(píng)估[J];牙體牙髓牙周病學(xué)雜志;2007年07期

8 軒昆;文玲英;金巖;;牙根發(fā)育不良疾病的研究進(jìn)展[J];牙體牙髓牙周病學(xué)雜志;2007年11期

9 軒昆,金巖,文玲英,李鑫,楊富生,鄭梁,金明;牙根發(fā)育不全疾病致病差異表達(dá)基因文庫(kù)的建立[J];臨床口腔醫(yī)學(xué)雜志;2003年10期

10 李燕玲;陳柯;;牙根發(fā)育機(jī)制的研究進(jìn)展[J];分子影像學(xué)雜志;2019年01期

相關(guān)會(huì)議論文 前5條

1 劉蒼維;史冊(cè);胡月;孫宏晨;;ACVR1通過(guò)調(diào)控根端復(fù)合體的增殖分化參與小鼠牙根發(fā)育的研究[A];2018全國(guó)口腔生物醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2018年

2 劉蒼維;史冊(cè);胡月;孫宏晨;;ACVR1通過(guò)調(diào)控根端復(fù)合體的增殖分化參與小鼠牙根發(fā)育的研究[A];2018口腔病理年會(huì)暨第十二次全國(guó)口腔病理學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2018年

3 李傳潔;李亞男;;Nfic基因的研究進(jìn)展[A];中華口腔醫(yī)學(xué)會(huì)口腔修復(fù)學(xué)專業(yè)委員會(huì)第十次全國(guó)口腔修復(fù)學(xué)術(shù)大會(huì)論文集[C];2016年

4 袁禮嬋;張陽(yáng);張宇新;馬俊青;;Gnai3參與牙齒發(fā)育的機(jī)制研究[A];2017全國(guó)口腔生物醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2017年

5 韓s

本文編號(hào)：2792039