發(fā)布時(shí)間：2020-08-11 20:45

【摘要】：目的 白假絲酵母菌(白色念珠菌)是人類(lèi)常見(jiàn)的條件致病真菌,生物膜是包括其在內(nèi)的幾乎所有微生物在自然界中的生存方式,生物膜微生物具有超強(qiáng)耐藥性。其可能機(jī)制包括：生物膜中胞外基質(zhì)抗藥物滲透的物理屏障作用、生物膜中菌株生長(zhǎng)遲緩導(dǎo)致對(duì)藥物的敏感性降低、基因突變耐藥株的產(chǎn)生等,但這些不能完全解釋生物膜耐藥性。 2001年, Lewis等發(fā)現(xiàn),銅綠假單胞菌生物膜中其實(shí)只有極少數(shù)菌株能夠耐受較高濃度的藥物作用且具有多藥耐受性,因其耐藥特征不具有遺傳性,被稱(chēng)為“滯留菌或持留菌(Persisters)”。Lewis認(rèn)為,這些菌株可能是生物膜耐藥性的真正原因,并且與臨床上常見(jiàn)的慢性反復(fù)性感染密切關(guān)聯(lián),但其形成機(jī)制尚不清楚。2006年,Lafleur等發(fā)現(xiàn)白假絲酵母菌中也存在“滯留菌”,但與細(xì)菌滯留菌不同的是,白假絲酵母菌滯留菌只存在于生物膜狀態(tài)。本實(shí)驗(yàn)首先進(jìn)行白假絲酵母菌生物膜中滯留菌形成的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè),分析白假絲酵母菌生物膜中滯留菌產(chǎn)生的形成特點(diǎn),確定滯留菌產(chǎn)生比例變化較大的兩狀態(tài)；進(jìn)一步運(yùn)用SSH(抑制性消減雜交)方法篩選兩狀態(tài)之間差異表達(dá)基因,即可能與滯留菌產(chǎn)生有關(guān)的基因,為下一步尋找滯留菌產(chǎn)生相關(guān)基因、揭開(kāi)其產(chǎn)生機(jī)制及相關(guān)途徑奠定基礎(chǔ)。 材料和方法 (1)白假絲酵母菌生物膜中滯留菌形成的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)及分析 分別以?xún)上嘈桶姿平z酵母菌標(biāo)準(zhǔn)菌液構(gòu)建體外生物膜模型,CFU計(jì)數(shù)法統(tǒng)計(jì)不同時(shí)間段生物膜加藥前真菌細(xì)胞繁列數(shù)目及加藥后滯留國(guó)產(chǎn)生數(shù)目,確定滯留菌產(chǎn)生數(shù)目變化較大的兩狀態(tài)；結(jié)合激光共聚焦顯微鏡(CLSM),觀(guān)察生物膜形態(tài)變化,分析滯留菌產(chǎn)生的影響因素。 (2)SSH方法構(gòu)建白假絲酵母菌兩狀態(tài)之間cDNA(?)肖減文庫(kù),初步篩選滯留菌產(chǎn)生相關(guān)基因 運(yùn)用SSH(抑制性消減雜交)技術(shù),針對(duì)上一步得出的白假絲酵母菌兩狀態(tài)之間進(jìn)行雙向雜交,分別篩選出兩狀態(tài)之間差異表達(dá)的基因,經(jīng)克隆擴(kuò)增、PCR方法鑒定重組質(zhì)粒,隨機(jī)挑選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序,并在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性比較。 結(jié)果 (1)兩相型菌液形成的不同時(shí)間段生物膜,真菌細(xì)胞繁殖數(shù)目及滯留菌數(shù)目均無(wú)顯著差異。其中,真菌細(xì)胞繁殖數(shù)目呈“S”形生長(zhǎng),12h后漸穩(wěn)定；滯留菌0.5h即大量產(chǎn)生,2h后數(shù)目已基本穩(wěn)定,此時(shí)鏡下生物膜處于微菌落始形成期。 (2)消減文庫(kù)構(gòu)建成功。經(jīng)鑒定,文庫(kù)獲得EST片段平均插入片段在300bp-600bp左右,重組率大于95%,正反向消減文庫(kù)的容量分別為2800和2600個(gè)；其中,正反向文庫(kù)分別挑選200個(gè)陽(yáng)性克隆子測(cè)序,共獲得388條有效EST,聚類(lèi)拼接后得到238條單基因簇(unigenes),包括53個(gè)重疊群(contigs)和185個(gè)單拷貝(singlets)。 結(jié)論 (1)白假絲酵母菌滯留菌的形成與其生物膜形成初期(2h內(nèi))附著表面的誘導(dǎo)密切相關(guān),而與其生物膜成熟程度及兩相型狀態(tài)無(wú)顯著關(guān)聯(lián)。 (2)SSH方法是快速篩選差異表達(dá)基因的有效方法,我們獲得的cDNA(?)肖減文庫(kù)為后續(xù)研究滯留菌產(chǎn)生機(jī)制及相關(guān)基因功能奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R780.2

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前3條

1 周艷宏;李桂源;;抑制消減雜交與基因芯片技術(shù)及其聯(lián)合應(yīng)用[J];國(guó)際腫瘤學(xué)雜志;2006年07期

2 李s

本文編號(hào)：2789548