發(fā)布時(shí)間：2020-08-11 09:32

【摘要】：牙周膜干細(xì)胞(peridontal ligament stem cells,PDLSCs)是從人的牙周膜中分離出來的具有多向分化潛能的一種間充質(zhì)干細(xì)胞,屬前體干細(xì)胞的一種,可分化為成骨樣細(xì)胞、成纖維細(xì)胞以及成牙骨質(zhì)樣細(xì)胞,在牙體、牙周組織發(fā)育以及組織再生修復(fù)中起重要作用。人牙周膜干細(xì)胞最早是于20世紀(jì)80年代初從人體牙周膜中分離獲取的,Seo等人研究證實(shí),牙周膜內(nèi)存在具有多向分化潛能的干細(xì)胞—牙周膜干細(xì)胞,屬于成體干細(xì)胞的一種,能產(chǎn)生特定表型和功能的成熟細(xì)胞,并在組織損傷、修復(fù)中發(fā)揮重要作用。近年來,因其在體外微環(huán)境刺激下可分化成為成骨細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞等,成為口腔領(lǐng)域的一種新興干細(xì)胞,被認(rèn)為是牙周組織再生的理想種子細(xì)胞。木通皂苷D(Akebia saponin D,ASD)是中國傳統(tǒng)中草藥材續(xù)斷、木通的活性成分,又被稱作續(xù)斷皂苷IV,ASD具有明確藥理活性,近年來主要用于制備促進(jìn)骨折愈合和治療骨質(zhì)疏松的藥物,其臨床效果安全可靠,對(duì)人體沒有明顯的毒副作用。程志安、張?jiān)戚x等人分別通過體外實(shí)驗(yàn)研究表明,木通皂苷D可明顯促進(jìn)成骨細(xì)胞與大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)的增殖與分化潛能,ASD顯著提高了成骨細(xì)胞的活性,促進(jìn)其鈣化,從而達(dá)到促進(jìn)骨折愈合防治骨質(zhì)疏松的效果。Yes相關(guān)蛋白(Yes-associatedprotein,YAP)是一種協(xié)同轉(zhuǎn)錄因子,YAP可穿梭于細(xì)胞質(zhì)與細(xì)胞核之間,其本身并不包括任何DNA結(jié)構(gòu)域,但它在各種生物中具有高度保守的ww結(jié)構(gòu)域,能夠識(shí)別結(jié)合富含脯氨酸的序列,增強(qiáng)蛋白與蛋白之間的作用,YAP在促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制細(xì)胞凋亡以及維持細(xì)胞干性等過程中起著重要作用。YAP進(jìn)入細(xì)胞核,與相應(yīng)的富含脯氨酸的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合以共同啟動(dòng)其下游目的基因的轉(zhuǎn)錄,當(dāng)下游基因被激活后,其主要功能是抑制細(xì)胞的凋亡和促進(jìn)細(xì)胞的增殖。有研究表明,在肝臟內(nèi)過表達(dá)YAP基因,能夠明顯促進(jìn)其增殖,而大大增加了肝臟的體積。近年來的研究表明,YAP對(duì)干細(xì)胞的增殖以及分化具有調(diào)節(jié)作用,在胚胎干細(xì)胞以及神經(jīng)干細(xì)胞中過表達(dá)YAP可促進(jìn)其增殖,增強(qiáng)其自我更新能力;而在異常病理狀態(tài)下,對(duì)YAP起抑制作用的作用因子減弱就會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞增殖能力異常升高,使細(xì)胞凋亡不足,從而引起腫瘤的發(fā)生。目的:本研究是通過在體外培養(yǎng)人牙周膜干細(xì)胞的基礎(chǔ)上,觀察木通皂苷D對(duì)人牙周膜干細(xì)胞細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期、表型維持及細(xì)胞增殖等生物學(xué)行為的影響,并對(duì)其相關(guān)機(jī)制進(jìn)行初步探究。方法施1.分離培養(yǎng)人PDLSCs:應(yīng)用組織塊法從12～18歲因正畸治療需要而拔除的健康的第一、二前磨牙上分離培養(yǎng)人PDLSCs,取3～6代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2.細(xì)胞凋亡檢測(cè):經(jīng)細(xì)胞凋亡試劑盒PI染色后,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ASD對(duì)人PDLSCs凋亡的影響。3.細(xì)胞周期檢測(cè):應(yīng)用細(xì)胞周期試劑盒PI染色后,通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)ASD對(duì)人PDLSCs細(xì)胞周期的影響。4.表面干性檢測(cè):應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)ASD對(duì)人PDLSCs表面干性維持相關(guān)因子Scleraxis、Col-I的表達(dá)情況。5.增殖能力檢測(cè):應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)檢測(cè)ASD對(duì)人PDLSCs增殖相關(guān)基因PCNA、Ki67、CyclinD1 的影響。6.ASD對(duì)人PDLSCs增殖機(jī)制的研究:通過轉(zhuǎn)染小干擾RNA靶向抑制人PDLSCs內(nèi)YAP基因的表達(dá),通過實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率,并通過定量PCR觀察ASD對(duì)增殖影響的變化。7.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:實(shí)驗(yàn)所有數(shù)據(jù)均采用SPSS19.0分析軟件進(jìn)行分析,將P0.05視作具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:1.應(yīng)用組織塊法成功分離培養(yǎng)出生長(zhǎng)狀態(tài)良好的人PDLSCs。2.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡的結(jié)果表明相對(duì)于陰性對(duì)照組,ASD對(duì)人PDLSCs的凋亡無明顯影響,其結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。3.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期表明相對(duì)于陰性對(duì)照組ASD組可明顯促進(jìn)人PDLSCs的細(xì)胞增殖,其結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4.實(shí)時(shí)定量PCR顯示表面干性相關(guān)因子Scleraxis的表達(dá)有所提高,但Col-I無明顯的變化。5.實(shí)時(shí)定量PCR顯示,增殖相關(guān)因子Ki67、CyclinD1的表達(dá)發(fā)生了顯著增加,PCNA表達(dá)變化較小,其結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。6.通過轉(zhuǎn)染shRNA可有效降低PDLSCs中YAP基因的表達(dá),其結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。7.降低PDLSCs中YAP基因的表達(dá)后,ASD不再能促進(jìn)PDLSCs的增殖,其結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。結(jié)論:1.組織塊法可用于人PDLSCs的分離及培養(yǎng),可得到生長(zhǎng)狀態(tài)良好的人PDLSCs。2.與陰性對(duì)照組相比,ASD對(duì)人PDLSCs無明顯的細(xì)胞毒性。3.ASD可促進(jìn)人PDLSCs的細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)行有絲分裂。4.ASD可促進(jìn)表面干性相關(guān)因子Scleraxis的表達(dá),但是對(duì)Col-I的作用不明顯。5.ASD對(duì)人PDLSCs的增殖有明顯的促進(jìn)作用,可明顯促進(jìn)增殖相關(guān)基因Ki67、CyclinD1的表達(dá),以加入木通皂苷D24h,其增殖基因Ki67、CyclinD1的表達(dá)達(dá)到最高,隨時(shí)間的延長(zhǎng),其表達(dá)量有所降低;較明顯的促進(jìn)PCNA的表達(dá),其變化量隨加藥時(shí)間的延長(zhǎng)變化較小。6.通過轉(zhuǎn)染小干擾RNA可效靶向降低人PDLSCs內(nèi)YAP基因的表達(dá),轉(zhuǎn)染效率高。7.ASD促進(jìn)PDLSCs的增殖可能與YAP基因有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R78
【圖文】：

圖１倒置顯微鏡下ＰＤＬＳＣｓ觀察圖片逡逑Ａ：原代細(xì)胞，７ｄ左右單個(gè)牙周膜細(xì)胞開Ｂ：原代細(xì)胞１４ｄ左右大量細(xì)胞從組織塊Ｃ：Ｐ２細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞擴(kuò)增繁殖到一定數(shù)量時(shí)細(xì)胞均一性好，生長(zhǎng)狀態(tài)良好。逡逑Ｆｉｇ邋１．邋ＰＤＬＳＣｓ邋ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ邋ｕｎｄｅｒ邋ｉｎｖｅｒｔｅｄ邋ｍｉＡ：邋Ａｆｔｅｒ邋７邋ｄａｙｓ邋，邋ｉｎｄｉｖｉｄｕａｌ邋ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ邋ｍｅｍｂｓｈｏｗｉｎｇ邋Ａ邋ｓｐｉｎｄｌｅ邋ｓｈａｐｅ．逡逑Ｂ：邋Ａｂｏｕｔ邋１４邋ｄａｙｓ，邋ａ邋ｌａｒｇｅ邋ｎｕｍｂｅｒ邋ｏｆ邋ｃｅｌｌｓ邋ｅｘｐａａ邋ｓｉｎｇｌｅ邋ｓｈａｐｅ邋ａｎｄ邋ａ邋ｇｏｏｄ邋ｇｒｏｗｔｈ邋ｓｔａｔｅ．逡逑Ｃ：邋Ｗｈｅｎ邋ｔｈｅ邋ｃｅｌｌｓ邋ａｒｅ邋ａｍｐｌｉｆｉｅｄ邋ａｎｄ邋ｍｕｌｔｉｐｌｉｅｂｅ邋ｓｅｅｎ邋ｔｈａｔ邋ｔｈｅ邋ｃｅｌｌｓ邋ｇｒｏｗ邋ｉｎ邋ａ邋ｓｐｉｎｄｌｅ邋ｓｈａｐｅ邋ｕｎｉｆｏｒｍｉｔｙ邋ａｎｄ邋ｇｒｏｗｔｈ邋ｓｔａｔｕｓ．逡逑

圖２邋ＡＳＤ對(duì)細(xì)胞凋亡的影響逡逑人ＰＤＬＳＣｓ經(jīng)ＰＩ染色后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ＡＳＤ對(duì)細(xì)胞凋亡的影響逡逑圖Ａ：陰性對(duì)照組逡逑圖Ｂ：邐ＡＳＤ處理組逡逑Ｆｉｇ．邋２邋Ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ＡＳＤ邋ｏｎ邋ａｐｏｐｔｏｓｉｓ逡逑Ｔｈｅ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ＡＳＤ邋ｏｎ邋ａｐｏｐｔｏｓｉｓ邋ｗａｓ邋ｄｅｔｅｃｔｅｄ邋ｂｙ邋ｆｌｏｗ邋ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ邋ａｆｔｅｒ邋ＰＩ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｏｆ邋ＰＤＬＳＣｓ逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋Ａ：邋Ｎｅｇａｔｉｖｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐ逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋Ｂ：邋ＡＳＤ邋ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ邋ｇｒｏｕｐ逡逑

圖３邋ＡＳＤ對(duì)細(xì)胞周期的影響逡逑人ＰＤＬＳＣｓ經(jīng)ＰＩ染色后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ＡＳＤ對(duì)細(xì)胞周期的影響逡逑圖Ａ：陰性對(duì)照組逡逑圖Ｂ：邋ＡＳＤ處理組逡逑Ｆｉｇ．邋３邋Ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ＡＳＤ邋ｏｎ邋ｃｅｌｌ邋ｃｙｃｌｅ逡逑Ｔｈｅ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ＡＳＤ邋ｏｎ邋ｃｅｌｌ邋ｃｙｃｌｅ邋ｗａｓ邋ｄｅｔｅｃｔｅｄ邋ｂｙ邋ｆｌｏｗ邋ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ邋ａｆｔｅｒ邋ＰＩ邋ｓｔａｉｎｉｎｇ邋ｏｆ邋ＰＤＬＳＣｓ逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋Ａ：邋Ｎｅｇａｔｉｖｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ邋ｇｒｏｕｐ逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋Ｂ：邋ＡＳＤ邋ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ邋ｇｒｏｕｐ逡逑

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本文編號(hào)：2788903