【摘要】：目的探討CDH12基因?qū)ο严傧贅幽倚园┘?xì)胞(SACC)侵襲能力的影響。方法應(yīng)用巢式RT-PCR法從涎腺腺樣囊性癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株SACC-M的總RNA中擴(kuò)增出CDH12cDNA;應(yīng)用AdEasyTMXL腺病毒載體系統(tǒng)構(gòu)建含人CDH12基因的重組腺病毒表達(dá)載體;轉(zhuǎn)染SACC-M細(xì)胞后,采用Western blot檢測CDH12蛋白分子的表達(dá),采用侵襲小室法檢測CDH12對SACC-M細(xì)胞侵襲能力的影響。結(jié)果 CDH12基因重組腺病毒及空腺病毒經(jīng)鑒定正確;Western blot檢測發(fā)現(xiàn),CDH12基因重組腺病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞(Ad-CDH12/SACC-M)組CDH12的表達(dá)水平明顯高于空腺病毒載體轉(zhuǎn)染(Ad0/SACC-M)對照組;與Ad0/SACC-M組相比,Ad-CDH12/SACC-M組細(xì)胞的侵襲能力明顯高于Ad0/SACC-M組(P0.01)。結(jié)論 CDH12能夠促進(jìn)涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞的體外侵襲能力,提示該基因在涎腺腺樣囊性癌的侵襲轉(zhuǎn)移中可能具有重要意義。
【圖文】：

Gold 感受態(tài)菌大量擴(kuò)增，腺病毒質(zhì)粒 pAd-CDH12及 pAd0 轉(zhuǎn)染 AD-293 細(xì)胞后會發(fā)生 CPE，熒光顯微鏡下可見綠色熒光蛋白（圖 3），說明 CDH12 基因重組腺病毒 Ad-CDH12 及空腺病毒 Ad0 包裝成功。2.3 Western blot 鑒定 N-cadherin 的表達(dá)Western blot 檢測結(jié)果顯示，感染 Ad-CDH12 和Ad0 的 SACC-M 細(xì)胞裂解物中均可見到 140 kDa 左右的 N-cadherin 帶。感染 Ad-CDH12 組表達(dá)水平比（N-cadherin/tubulin）明顯高于感染空腺病毒載體的Ad0 組，說明腺病毒載體能很好地表達(dá) CDH12 蛋白。見圖 4。2.4 CDH12 對 SACC-M 細(xì)胞侵襲能力的影響B(tài)ioCoatTMMatrigelTMInvasion Chamber 已經(jīng)重建了基底膜膠，在聚碳酸脂膜表面形成類似天然基底膜的結(jié)構(gòu)，細(xì)胞侵襲穿過重建基底膜膠的能力可反映該細(xì)胞的侵襲能力。Ad-CDH12/SACC-M 組 48 h后穿過侵襲小室聚碳酸脂膜的細(xì)胞數(shù) （88.00±9 . 70）明顯多于 Ad0/SACC-M 組（42.80±4.92）（P ＜0.01），說明 Ad-CDH12/SACC-M 細(xì)胞的侵襲能力明顯增強(qiáng)。見圖 5。M，BM5000 DNA marker；1

化后轉(zhuǎn)化 BJ5183 感受態(tài)菌，在 BJ5183 中與腺病毒骨架質(zhì)粒 pAdEasy-1 發(fā)生同源重組，Pac Ⅰ酶切鑒定獲得正確的腺病毒質(zhì)粒（圖 2），將其轉(zhuǎn)化 XL 10-Gold 感受態(tài)菌大量擴(kuò)增，腺病毒質(zhì)粒 pAd-CDH12及 pAd0 轉(zhuǎn)染 AD-293 細(xì)胞后會發(fā)生 CPE，熒光顯微鏡下可見綠色熒光蛋白（圖 3），說明 CDH12 基因重組腺病毒 Ad-CDH12 及空腺病毒 Ad0 包裝成功。2.3 Western blot 鑒定 N-cadherin 的表達(dá)Western blot 檢測結(jié)果顯示，感染 Ad-CDH12 和Ad0 的 SACC-M 細(xì)胞裂解物中均可見到 140 kDa 左右的 N-cadherin 帶。感染 Ad-CDH12 組表達(dá)水平比（N-cadherin/tubulin）明顯高于感染空腺病毒載體的Ad0 組，說明腺病毒載體能很好地表達(dá) CDH12 蛋白。見圖 4。2.4 CDH12 對 SACC-M 細(xì)胞侵襲能力的影響B(tài)ioCoatTMMatrigelTMInvasion Chamber 已經(jīng)重建了基底膜膠，在聚碳酸脂膜表面形成類似天然基底膜的結(jié)構(gòu)

基因兩端引入 Nhe Ⅰ和 Xho Ⅰ酶切位點。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，在約 2.7 kb 處可見 1 明亮條帶，與目的片段大小一致（圖 1）。目的基因與 T 載體連接后，經(jīng)測序證實與 GenBank 登錄的人 CDH12基因序列一致。2.2 CDH12 重組腺病毒表達(dá)載體的鑒定測序正確的重組子 pMD18T-CDH12 經(jīng) Nhe Ⅰ和 Xho Ⅰ雙酶切后，將 CDH12 亞克隆至腺病毒穿梭載體 pShuttle-IRES-hrGFP-1，然后經(jīng) Pme I 線性化后轉(zhuǎn)化 BJ5183 感受態(tài)菌，在 BJ5183 中與腺病毒骨架質(zhì)粒 pAdEasy-1 發(fā)生同源重組，Pac Ⅰ酶切鑒定獲得正確的腺病毒質(zhì)粒（圖 2），將其轉(zhuǎn)化 XL 10-Gold 感受態(tài)菌大量擴(kuò)增，腺病毒質(zhì)粒 pAd-CDH12及 pAd0 轉(zhuǎn)染 AD-293 細(xì)胞后會發(fā)生 CPE

【參考文獻(xiàn)】

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【共引文獻(xiàn)】

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【二級參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2788892