【摘要】：目的:通過建立骨皮質(zhì)切開術加速牙移動動物模型,研究巨噬細胞在骨皮質(zhì)切開介導的正畸牙移動加速進程中的作用及機制,為巨噬細胞調(diào)控正畸牙移動提供新的證據(jù)。材料與方法:將8周齡雄性Wistar大鼠及8周齡成年雄性C57BL/6小鼠隨機分成實驗組(CO+TM),對照組(TM)和空白組。分別對實驗組,對照組大、小鼠上頜左側(cè)第一磨牙實施正畸加力,同時對實驗組同期行骨皮質(zhì)切開術。分別在第3 d,5 d,7 d,14 d,21 d,28 d,42 d七個時間點收取大鼠,第5 d,7 d,14 d,21 d四個亞組收取小鼠。取上頜骨行Micro-CT檢查,測量牙齒移動距離及移動牙周圍骨密度改變。通過免疫組化染色技術觀察大鼠牙周形態(tài)學改變、破骨細胞及巨噬細胞浸潤。取大鼠移動磨牙腭側(cè)牙齦,通過RT-PCR檢測巨噬細胞數(shù)量以及極性分化標志物mRNA表達水平,并通過流式細胞術檢測巨噬細胞極性分化。隨后通過注射氯膦酸鹽建立巨噬細胞清除模型,進一步驗證巨噬細胞的作用。通過牙周組織與骨髓源性巨噬細胞共培養(yǎng),RT-PCR檢測巨噬細胞極性分化改變,Western blot檢測巨噬細胞極化相關蛋白p65以及STAT3磷酸化水平。結果:1.骨皮質(zhì)切開術顯著加速大鼠牙齒移動距離與速率:在牙齒移動第5天到第42開,實驗組的移動距離顯著高于對照組并具有統(tǒng)計學差異。牙齒移動初期(第3天)牙齒移動速率最大,且對照組高于實驗組,而后兩組大鼠移動速率開始降低,直至第14天,為速率變化的轉(zhuǎn)折點,其后移動速率又開始提高。第21天時,實驗組的移動速率明顯高于對照組。我們通過骨密度測量發(fā)現(xiàn),實驗組骨密度在牙移動的第3、7、14、28天均顯著低于對照組。2.骨皮質(zhì)切開術促進牙移動中牙周組織中破骨細胞和巨噬細胞的增加:通過TRAP染色發(fā)現(xiàn),在第14天左右破骨細胞數(shù)量達頂峰,且實驗組顯著高于對照組。通過免疫組化染色發(fā)現(xiàn),從第5天到第42天,實驗組大鼠移動牙壓力側(cè)棕黃色的CD11b陽性細胞陽性率顯著高于對照組;而實驗組壓力側(cè)棕黃色的CD68陽性細胞陽性率則在第5-14天時顯著高于對照組。通過RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)CD68和CD11b基因在實驗組和對照組的表達變化趨勢基本一致。但實驗組CD68和CD11b基因的表達量在第5-21天顯著高于對照組。同時,流式細胞術檢測分析顯示實驗CD11b~+細胞陽性率從第5天到第21天始終高于對照組。3.骨皮質(zhì)切開術促進牙移動中巨噬細胞的極化:通過免疫組化染色顯示,從第5天到第21天,實驗組大鼠移動牙壓力側(cè)棕黃色的CD86顯著高于對照組(TM);同時,除第14天外實驗組壓力側(cè)棕黃色的CD163陽性細胞率也顯著高于對照組。流式細胞術檢測分析顯示實驗組CD11b~+CD86~+細胞陽性率從第5天到第21天始終高于對照組,而實驗組CD11b~+CD163~+細胞陽性率除第14天外都顯著高于對照組。通過RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)實驗組和對照組CD86基因的表達量在第5天到第14天呈逐步上升趨勢,且實驗組顯著高于對照組。而實驗組與對照組在CD163基因的表達量上趨勢基本一致,且實驗組CD163基因的表達量除第42天均顯著高于對照組。與CD86基因表達量相一致的是,炎癥型巨噬細胞相關因子IL-1β及TNF-α的基因表達量在牙移動早中期第5天和第14天時即顯著性的高于對照組;而修復型巨噬細胞相關因子Arg-1及CD206表達量在牙移動早期第5天時和第21天時顯著高于對照組。4.巨噬細胞清除抑制了骨皮質(zhì)切開術引起的牙齒加速移動:在巨噬細胞清除模型中,與對照組相比,巨噬細胞清除組循環(huán)來源的單核細胞降低了70%,且巨噬細胞清除組牙齦組織中CD11b~+F4/80~+細胞陽性率也明顯降低,其中,CD86~+和CD206~+細胞陽性率也明顯降低。我們進一步通過Micro-CT觀察了小鼠牙齒移動的基本情況。實驗組的移動距離在第5天到第21天均顯著大于對照組,而該移動距離增加的現(xiàn)象則在巨噬細胞清除后明顯降低,同時,在巨噬細胞清除后,巨噬細胞清除組第5天到第14天中牙移動速率顯著低于骨皮質(zhì)切開組。5.骨皮質(zhì)切開術通過NF-κB及JAK-STAT信號通路調(diào)控巨噬細胞極化分型:通過對小鼠骨髓源性巨噬細胞(BMDMs)給予新鮮牙齦組織懸液刺激并運用RT-PCR分析巨噬細胞分型情況,結果顯示,炎癥型巨噬細胞相關因子TNF-α及IL-1β的基因表達量在牙移動早中期第5天和第14天時即顯著性的高于對照組,隨后開始下降。而修復型巨噬細胞相關因子Arg-1及CD206表達量在牙移動早期第5、14和21天時顯著高于對照組且實驗組兩種目的基因的表達量總體趨勢基本一致,即在第5天時表達增高而后第14天時開始下降直到第21天再次回升。通過western blot對巨噬細胞分析發(fā)現(xiàn),與對照組相比,骨皮質(zhì)切開組p65蛋白表達量在刺激第5-7天時顯著增高。同時,磷酸化的STAT3蛋白表達量在第5天時顯著高于對照組,而后開始下降,并在第21天時再次增高并顯著高于對照組。結論:骨皮質(zhì)切開術可以促進局部微環(huán)境中巨噬細胞的募集并極化改變,進而加速正畸牙移動,其中NF-κB及JAK-STAT信號通路的激活在巨噬細胞極化中發(fā)揮重要作用。
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R783.5
【圖文】：

切口長約3 mm，穿透牙齦，深達骨膜下1 mm。每日使用生理鹽水沖洗上頜磨牙并24h監(jiān)控大小鼠口內(nèi)的加力裝置，若有損壞或脫落，及時重新安裝。圖1 動物模型示意圖A圖：左上頜第一磨牙加載正畸加力裝置；B圖：箭頭所示為第一磨牙近遠中切口；C圖：箭頭所示為預實驗翻瓣后所見的切口2.4體內(nèi)清除巨噬細胞動物模型的建立實驗組小鼠再隨機分為兩組（5-6只/組）：氯膦酸鹽清除組（CO + TM + LEC）和對照組（CO + TM）。氯膦酸鹽清除組小鼠從牙移動的前一天開始每隔4天通過眼球后靜脈叢注射氯膦酸鹽以清除巨噬細胞，建立巨噬細胞清除模型，對照組小鼠則注射PBS做對照[37]。在巨噬細胞清除組中建立骨皮質(zhì)切開加速正畸模型，并于術后 5、7、14、21 d處死（圖2）。

南京醫(yī)科大學碩士學位論文18圖2 體內(nèi)清除巨噬細胞動物模型的建立2.5樣本采集所有大小鼠分別在預定加力截止當天注射過量麻藥后頸椎脫位處死。采集移動磨牙的腭側(cè)牙齦，用于RT-PCR分析（5-6只/組）和流式細胞術檢測（5-6只/組）。同時取移動磨牙的腭側(cè)牙齦（6只/組），加入含1% FBS的DMEM培養(yǎng)液中，用研磨法制成單細胞懸液后，無菌條件下0.22μm過濾器過濾后得無菌牙齦組織溶液。同時將上頜骨完整取出，4%多聚甲醛固定48 h后，進行Micro-CT掃描分析及組織學檢測。2.6骨髓源性巨噬細胞細胞的分離培養(yǎng)和刺激用DMEM完全培養(yǎng)基(含10% FBS)于37°C、5%的CO2孵箱中培養(yǎng)L929細胞3~ 5 d，然后收集細胞上清，無菌條件下0.22μm過濾器過濾后備用。（1）斷頸處死雄性 4 周齡 C57BL/6 小鼠，投入 75%酒精中浸泡 3-5 分鐘

CD86+和 CD206+細胞陽性率也明顯降低（圖6F，6G）。我們進一步通過 Micro-CT 觀察了小鼠牙齒移動的基本情況。實驗組的移動距離在第 5 天到第 21 天均顯著大于對照組（圖 6H，6I），而該移動距離增加的現(xiàn)象則在巨噬細胞清除后明顯降低，同時，在巨噬細胞清除后，巨噬細胞清除組第 5 天到第 14 天中牙移動速率顯著低于骨皮質(zhì)切開組（圖 6J）。結果提示巨噬細胞在骨皮質(zhì)切開術加速正畸牙移動中發(fā)揮了重要作用。

【參考文獻】

相關期刊論文 前5條

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本文編號：2786404