【摘要】：研究背景牙髓炎和根尖周炎是目前口腔醫(yī)學(xué)領(lǐng)域在臨床上除齲病外較為常見的疾病,牙髓受損后由于其特殊的組織學(xué)特征難以自行恢復(fù)。目前國(guó)際上較為公認(rèn)的針對(duì)這類患牙的治療方式,是在無菌的前提下對(duì)患牙進(jìn)行根管治療�；佳朗パ浪杞M織后由于其血運(yùn)的喪失和免疫系統(tǒng)的失效,其脆性增強(qiáng),同時(shí)抗折性能也會(huì)降低。因此,其更為理想的治療方式應(yīng)該包含牙髓重建,即再生性牙髓治療。人牙髓干細(xì)胞(Human dental pulp stem cells,hDPSCs)是一類間充質(zhì)干細(xì)胞的衍生細(xì)胞,由于其較強(qiáng)的增殖能力以及易于獲得的特性,被認(rèn)為是用于牙髓再生治療的一類理想種子細(xì)胞。目前為止,大多數(shù)學(xué)者對(duì)于牙髓干細(xì)胞的體外培養(yǎng)微環(huán)境為21%氧濃度微環(huán)境即常氧。然而牙髓干細(xì)胞在體內(nèi)所處的微環(huán)境為低氧。氧氣濃度直接影響細(xì)胞增殖能力、多向分化潛能、凋亡水平以及損傷修復(fù)等生物學(xué)進(jìn)程。因此,為進(jìn)一步研究牙髓干細(xì)胞在體內(nèi)的生物學(xué)特性,本研究選用不同低氧濃度于體外培養(yǎng)人牙髓干細(xì)胞,并探討其對(duì)人牙髓干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響。材料與方法1人牙髓干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)和鑒定本實(shí)驗(yàn)使用18-22歲來我院就診的患者需要拔除的健康完整、且不患有牙體牙周疾病的阻生第三磨牙或因正畸拔除的雙尖牙,采用改良組織塊酶消化法分離培養(yǎng)人牙髓干細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記物。對(duì)培養(yǎng)的人牙髓干細(xì)胞進(jìn)行成骨、成軟骨、成脂誘導(dǎo)14d后,分別使用茜素紅S、阿里新蘭及油紅O染色劑染色,置于倒置顯微鏡下觀察其分化能力。2不同低氧濃度對(duì)人牙髓干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響不同低氧濃度微環(huán)境下培養(yǎng)人牙髓干細(xì)胞,利用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測(cè)人牙髓干細(xì)胞的細(xì)胞骨架及細(xì)胞核的形態(tài)。取第2-5代人牙髓干細(xì)胞,使用CCK8方法以進(jìn)一步檢測(cè)人牙髓干細(xì)胞的細(xì)胞增殖能力,計(jì)算數(shù)據(jù)并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線并利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。倍比稀釋法將人牙髓干細(xì)胞接種于培養(yǎng)皿中,利用平板集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞單克隆形成情況并計(jì)算克隆形成率。同時(shí),利用瓊脂糖凝膠電泳法檢測(cè)細(xì)胞DNA凋亡小體形成情況。3不同低氧濃度對(duì)人牙髓干細(xì)胞成牙本質(zhì)向分化的影響Trizol法分別提取不同低氧濃度條件下培養(yǎng)對(duì)照組和成牙本質(zhì)誘導(dǎo)組細(xì)胞總RNA和全蛋白,NanoDrop ND-1000紫外分光光度計(jì)用以檢測(cè)RNA濃度與純度后,qRT-PCR檢測(cè)各組人牙髓干細(xì)胞成牙本質(zhì)向分化相關(guān)基因的表達(dá)變化,Western Blot檢測(cè)與成牙本質(zhì)相關(guān)蛋白的表達(dá)變化,并在成骨誘導(dǎo)14 d后進(jìn)行茜素紅S及ALP染色檢驗(yàn)不同低氧濃度對(duì)成牙本質(zhì)向分化能力的影響。4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用采用graphpad prism 5統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采用Two-way ANOVA分析,先進(jìn)行Levene方差齊性檢驗(yàn),方差不齊式用Welch校正;組間多重比較,方差齊性時(shí)采用LSD法,方差不齊時(shí)采用Dunnett T3檢驗(yàn),P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果1人牙髓干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定成功分離培養(yǎng)人牙髓干細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示細(xì)胞表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記物,造血干細(xì)胞表面標(biāo)記物表達(dá)呈陰性。經(jīng)成骨、成軟骨及成脂向誘導(dǎo)后可見大量礦化結(jié)節(jié)、大量藍(lán)染粘多糖聚集和橘紅色脂滴聚集。2不同低氧濃度對(duì)人牙髓干細(xì)胞生物學(xué)特性的影響免疫熒光結(jié)果顯示,三組細(xì)胞形態(tài)有差異,其中,3%低氧下培養(yǎng)的牙髓干細(xì)胞具有更大的細(xì)胞核,而5%和21%的細(xì)胞核大小無明顯差異。CCK8結(jié)果顯示,三組細(xì)胞均有較強(qiáng)的細(xì)胞增殖能力。流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期結(jié)果示,三組細(xì)胞周期的S/G/M分期比率較高。利用平板集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果為均可形成克隆。其中,3%低氧克隆形成率大于常氧進(jìn)而大與于5%低氧。脂糖凝膠電泳實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,不同氧濃度低氧環(huán)境下提取的細(xì)胞DNA較完整,無明顯的DNA破碎片段。3不同低氧濃度對(duì)人牙髓干細(xì)胞成牙本質(zhì)向分化的影響相對(duì)于常氧微環(huán)境,5%低氧微環(huán)境可使人牙髓干細(xì)胞的成牙本質(zhì)向分化相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)上調(diào),而3%氧濃度微環(huán)境使hDPSCs的成牙本質(zhì)向分化相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)下調(diào)。不同低氧濃度微環(huán)境條件下培養(yǎng)的細(xì)胞對(duì)照組未發(fā)現(xiàn)明顯的礦化結(jié)節(jié)形成。而各礦化組可見散在紅褐色的礦化結(jié)節(jié),其中,3%低氧條件下培養(yǎng)的礦化組礦化結(jié)節(jié)體積最小且數(shù)量最少,5%低氧條件下培養(yǎng)的礦化組礦化結(jié)節(jié)體積最大且數(shù)量最多。結(jié)論1人牙髓組織經(jīng)組織塊酶消化法獲得的細(xì)胞為成纖維樣細(xì)胞形態(tài)、呈長(zhǎng)梭形,細(xì)胞貼壁生長(zhǎng),同時(shí)增殖速度較快�？烧J(rèn)為是來源于成人恒牙牙髓組織的一類間充質(zhì)干細(xì)胞,具有多向分化的潛能,可以認(rèn)為是hDPSCs;2不同氧濃度的微環(huán)境條件,對(duì)hDPSCs的形態(tài)、增殖、細(xì)胞周期和克隆形成能力均有較大的影響,而細(xì)胞凋亡能力則沒有明顯的差異;3相對(duì)于21%氧濃度微環(huán)境,5%氧濃度微環(huán)境可促進(jìn)hDPSCs的成牙本質(zhì)向分化,而3%氧濃度微環(huán)境抑制hDPSCs的成牙本質(zhì)向分化。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R78
【圖文】：

ｈＤＰＳＣｓ經(jīng)成牙本質(zhì)／成骨誘導(dǎo)１４ｄ后，可見一部分ｈＤＰＳＣｓ呈現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改逡逑變，細(xì)胞形態(tài)更為細(xì)長(zhǎng)，細(xì)胞核縮小。誘導(dǎo)組經(jīng)染色后可見不規(guī)則的紅褐色物質(zhì)，逡逑被認(rèn)為是經(jīng)礦化后所得的礦化結(jié)節(jié)（圖１－３Ｂ），而對(duì)照組幾乎無紅褐色物質(zhì)，細(xì)逡逑胞形態(tài)無明顯變化（圖１－３邋Ａ）。逡逑２．３．２成軟骨分化逡逑ｈＤＰＳＣｓ經(jīng)成軟骨誘導(dǎo)１４ｄ后，可見部分區(qū)域的細(xì)胞逐漸變?yōu)閺?fù)層生長(zhǎng)，細(xì)胞逡逑形態(tài)逐漸變?yōu)檩^大的多邊圓形，經(jīng)染色后可見藍(lán)染粘多糖聚集在細(xì)胞復(fù)層生長(zhǎng)的逡逑區(qū)域（圖１－３Ｄ）。而對(duì)照組細(xì)胞無明顯變化（圖１－３Ｃ）。逡逑２．３．３成脂分化逡逑ｈＤＰＳＣｓ經(jīng)成脂誘導(dǎo)１４ｄ后，細(xì)胞增殖生長(zhǎng)被抑制，數(shù)量逐漸減少。可見細(xì)逡逑胞間質(zhì)含少量橙紅色脂滴（圖１－３Ｆ）。而對(duì)照組細(xì)胞無明顯變化（圖１－３Ｅ）。逡逑１０逡逑

邐ＣＤ３４ＰＥ．Ａ邐ＣＤ４５邋ＦｌＴＣ邋Ａ逡逑圖１－２邋ｈＤＰＳＣｓ的表面標(biāo)記物流式檢測(cè)逡逑Ｆｉｇ．邋１－２邋Ｃｅｌｌ邋ｓｕｒｆａｃｅ邋ｍａｒｋｅｒｓ邋ｏｆ邋ｈＤＰＳＣｓ邋ｂｙ邋ｆｌｏｗ邋ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ逡逑２．３多向分化能力逡逑２．３．１成牙本質(zhì)／成骨分化逡逑ｈＤＰＳＣｓ經(jīng)成牙本質(zhì)／成骨誘導(dǎo)１４ｄ后，可見一部分ｈＤＰＳＣｓ呈現(xiàn)細(xì)胞形態(tài)學(xué)改逡逑變，細(xì)胞形態(tài)更為細(xì)長(zhǎng)，細(xì)胞核縮小。誘導(dǎo)組經(jīng)染色后可見不規(guī)則的紅褐色物質(zhì)，逡逑被認(rèn)為是經(jīng)礦化后所得的礦化結(jié)節(jié)（圖１－３Ｂ），而對(duì)照組幾乎無紅褐色物質(zhì)，細(xì)逡逑胞形態(tài)無明顯變化（圖１－３邋Ａ）。逡逑２．３．２成軟骨分化逡逑ｈＤＰＳＣｓ經(jīng)成軟骨誘導(dǎo)１４ｄ后，可見部分區(qū)域的細(xì)胞逐漸變?yōu)閺?fù)層生長(zhǎng)，細(xì)胞逡逑形態(tài)逐漸變?yōu)檩^大的多邊圓形，經(jīng)染色后可見藍(lán)染粘多糖聚集在細(xì)胞復(fù)層生長(zhǎng)的逡逑區(qū)域（圖１－３Ｄ）。而對(duì)照組細(xì)胞無明顯變化（圖１－３Ｃ）。逡逑２．３．３成脂分化逡逑ｈＤＰＳＣｓ經(jīng)成脂誘導(dǎo)１４ｄ后，細(xì)胞增殖生長(zhǎng)被抑制，數(shù)量逐漸減少。可見細(xì)逡逑胞間質(zhì)含少量橙紅色脂滴（圖１－３Ｆ）。而對(duì)照組細(xì)胞無明顯變化（圖１－３Ｅ）。逡逑１０逡逑

２．２不同低氧濃度微環(huán)境對(duì)ｈＤＰＳＣｓ細(xì)胞周期的影響逡逑通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)兩種不同低氧濃度條件培養(yǎng)下ｈＤＰＳＣｓ的細(xì)胞周期分布，逡逑實(shí)驗(yàn)重復(fù)３次（圖２－２、表２－６）。其中，不同低氧濃度條件培養(yǎng)下細(xì)胞處在Ｇ１期的逡逑所占比例最高

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本文編號(hào)：2783771