【摘要】：目的： 齲病是一種發(fā)生于牙體硬組織的由口腔常在菌引起的內(nèi)源性感染性疾病,在各種疾病的發(fā)病率中,齲病位居前列。我國第三次全國口腔健康流行病學(xué)抽樣調(diào)查結(jié)果顯示,現(xiàn)在最突出的口腔健康問題表現(xiàn)在齲齒上：5歲兒童乳牙齲齒的患病率為66%,35～44歲中年人齲齒患病率為88.1%,65～74歲老年人齲齒患病率高達(dá)98.4%。不僅如此,齲病及其并發(fā)的牙髓病和根尖周病是口腔科就診率最高的病種。鑒于齲病的常見性和多發(fā)性,齲病預(yù)防的意義遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于被動治療。 齲病發(fā)生、發(fā)展的過程只有依靠牙菌斑才能介導(dǎo)和完成。因此,通過適當(dāng)?shù)姆椒ㄓ绊懷谰呱锬?nèi)細(xì)菌的生長代謝,干擾牙菌斑形成或促使牙菌斑解離,即可達(dá)到預(yù)防齲病的目的。本實驗首先通過應(yīng)用波長532nm的半導(dǎo)體激光器和光敏劑血卟啉單甲醚(hematoporphyrin monomethylether, HMME)對四種主要致齲菌混合菌懸液進(jìn)行光動力治療,探討光動力療法(Photodynamic Therapy, PDT)對致齲菌是否具有殺滅作用,并篩選出PDT的最佳效應(yīng)參數(shù)；體外建立混合菌菌斑生物膜進(jìn)行光動力實驗,探討PDT對菌斑生物膜結(jié)構(gòu)、細(xì)菌活性和產(chǎn)酸能力的影響,并驗證單線態(tài)氧在HMME-PDT殺菌過程中的作用。 方法： 1.變形鏈球菌、血鏈球菌、嗜酸性乳桿菌和粘性放線菌分別于37℃厭氧環(huán)境中培養(yǎng)48h復(fù)蘇,制備成1×108CFU/mL的混合菌懸液備用。 2.混合菌懸液分別與濃度為10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml、60μg/ml的HMME37℃黑暗中孵育5分鐘后,應(yīng)用波長532nm半導(dǎo)體激光器照射30s、60s、90s、120s,處理完畢進(jìn)行菌落計數(shù),與對照組進(jìn)行比較,選擇PDT最佳效應(yīng)的實驗參數(shù),為下一步的菌斑生物膜模型實驗提供依據(jù) 3.體外環(huán)境下,選擇四種口腔主要致齲菌在牙釉質(zhì)表面形成混合菌菌斑生物膜。實驗分為5組：HMME-PDT組、HMME-PDT加疊氮鈉組、單純疊氮鈉處理組、陽性對照西吡氯銨處理組、陰性對照生理鹽水處理組。根據(jù)平板落計數(shù)和24小時內(nèi)PH值測定結(jié)果觀察HMME-PDT對菌斑生物膜內(nèi)細(xì)菌活性和產(chǎn)酸能力的影響。通過激光共聚焦顯微鏡(Confocal Laser Scan Microscope, CLSM)觀察HMME-PDT對菌斑生物膜結(jié)構(gòu)的影響。 結(jié)果： 1.混合菌菌懸液實驗平板菌落計數(shù)結(jié)果顯示,在本實驗條件下,HMME-PDT對致齲菌最佳效應(yīng)的實驗參數(shù)為：光敏劑HMME濃度40μg/ml,波長532nm、功率密度0.14W/cm2半導(dǎo)體激光器連續(xù)照射90s。 2.根據(jù)HMME-PDT對混合菌菌斑生物膜中細(xì)菌作用的平板菌落計數(shù)結(jié)果顯示：與陰性對照生理鹽水處理組相比,單純疊氮鈉組對混合菌菌斑生物膜中細(xì)菌的生長幾乎沒有影響(P0.05)；西吡氯銨處理組可使混合菌菌斑生物膜內(nèi)細(xì)菌數(shù)量減少(P0.05),殺菌率為51.86%；而HMME-PDT組可使混合菌菌斑生物膜內(nèi)細(xì)菌的數(shù)量顯著減少(P0.05),殺菌率高達(dá)94.92%；HMME-PDT+疊氮鈉組對混合菌菌斑生物膜中細(xì)菌的殺滅作用不明顯(P0.05),殺菌率僅為9.47%。 3.由24小時內(nèi)不同時間點不同處理組上清液的pH值結(jié)果可以看出,與生理鹽水處理組相比,HMME-PDT及西吡氯銨處理均可使混合菌菌斑生物膜內(nèi)細(xì)菌產(chǎn)酸能力顯著降低,其"縫H (pH的變化幅度)明顯減小(P0.05)；HMME-PDT組與西吡氯銨處理組相比仍有顯著性差異(P0.05),且在HMME-PDT處理24h后培養(yǎng)物上清的pH值為6.01,高于致齲臨界pH值(5.0～5.5)；HMME-PDT+疊氮鈉組和單純疊氮鈉處理組對生物膜內(nèi)細(xì)菌代謝產(chǎn)酸沒有顯著影響,"縫H值無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 4.CLSM斷層掃描圖像顯示：生理鹽水處理組菌斑生物膜底層和表層細(xì)菌較少、較稀疏；中間層細(xì)菌明顯增多,密集,層疊如棉絮狀；三維重建圖像可見生物膜結(jié)構(gòu)致密,有一定厚度,中間有許多暗黑的管道系統(tǒng)。HMME-PDT處理后的菌斑生物膜底層和表層幾乎無細(xì)菌存在；中間層有少許細(xì)菌存活,細(xì)菌之間間隙較大,呈星點樣散布；菌斑生物膜整體結(jié)構(gòu)稀疏分散,未形成典型的三維立體結(jié)構(gòu)。 結(jié)論： 1.HMME-PDT對混合菌菌懸液有明顯的殺傷作用,殺傷效果與光敏劑濃度、激光照射時間有著密切的關(guān)系。 2.HMME-PDT可以明顯降低菌斑生物膜中細(xì)菌的活性并抑制其代謝產(chǎn)酸。 3.單線態(tài)氧在HMME-PDT殺菌過程中起著極其重要的作用。 4.HMME-PDT可以破壞菌斑生物膜結(jié)構(gòu)的完整性,促進(jìn)其解離。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R781.1

【參考文獻(xiàn)】

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2 姬亞昆;凌均h

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