發(fā)布時(shí)間：2020-07-31 08:28

【摘要】：成纖維細(xì)胞是廣泛分布于體內(nèi)的間質(zhì)細(xì)胞，人牙髓成纖維細(xì)胞（Human DentalPulp Fibroblasts，HDPF）作為牙髓中的主體細(xì)胞，傳統(tǒng)的觀念認(rèn)為其主要負(fù)責(zé)合成細(xì)胞外基質(zhì)，近來研究發(fā)現(xiàn)HDPF在牙髓免疫和炎癥中發(fā)揮重要的作用，可能成為未來牙髓炎癥抗炎治療的潛在靶點(diǎn)。 Nemosis是新近報(bào)道發(fā)生在成纖維細(xì)胞的一種細(xì)胞激活和死亡形式。J Bizik等學(xué)者最早發(fā)現(xiàn)正常的成纖維細(xì)胞如果誘使其形成“球狀”集落，其非但不生長(zhǎng)，反而經(jīng)歷一種被稱為“nemosis”的細(xì)胞激活途徑[1]。發(fā)生nemosis的成纖維細(xì)胞首先形成“球狀”聚集，隨后產(chǎn)生促炎性，蛋白水解和生長(zhǎng)因子應(yīng)答，于此同時(shí)開始自發(fā)性分解，此過程具有程序性細(xì)胞壞死的特征[2-4]。已報(bào)道nemosis能發(fā)生于包括新生兒包皮成纖維細(xì)胞，新生兒和成人皮膚成纖維細(xì)胞等，但牙髓組織的主體細(xì)胞HDPF能否發(fā)生nemosis，至今少有研究[2,4]。 Nemosis可用來研究成纖維細(xì)胞的激活以及成纖維細(xì)胞與周圍細(xì)胞之間關(guān)系，是一種重要的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚2]。迄今，nemosis作用的靶細(xì)胞包括癌細(xì)胞，上皮細(xì)胞，內(nèi)皮細(xì)胞和免疫細(xì)胞，nemosis作用的靶細(xì)胞是否包括干細(xì)胞以及之間的相互作用，國(guó)內(nèi)外未見有報(bào)道。為此本實(shí)驗(yàn)通過三維培養(yǎng)HDPF構(gòu)建nemosis模型，探討HDPF發(fā)生nemosis的特診，并在此基礎(chǔ)上運(yùn)用nemosis模型，研究HDPF發(fā)生nemosis對(duì)人牙髓干細(xì)胞（human dental pulp stem cells，hDPSCs）細(xì)胞遷移的影響，為干細(xì)胞修復(fù)炎癥損傷牙髓提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 1、三維培養(yǎng)HDPF形成球狀聚集的研究 成纖維細(xì)胞激活nemosis途徑起始于在U形96孔板板底預(yù)先用瓊脂鋪板后三維培養(yǎng)成纖維細(xì)胞，這種三維培養(yǎng)體系鮮明的形態(tài)學(xué)特征就是形成肉眼可見的球狀細(xì)胞聚集體。 在第一部分實(shí)驗(yàn)，我們通過反復(fù)摸索實(shí)驗(yàn)條件，三維培養(yǎng)HDPF構(gòu)建HDPF形成球狀細(xì)胞聚集體，在此基礎(chǔ)上分別用CCK8實(shí)驗(yàn)和LDH實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了三維培養(yǎng)的HDPF和普通HDPF細(xì)胞代謝和胞膜損傷的研究，結(jié)果表明隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，三維培養(yǎng)的HDPF細(xì)胞活力受到影響，活細(xì)胞數(shù)逐漸減少，細(xì)胞胞膜損傷程度逐漸加重，掃描電鏡（SEM）和透射電鏡（TEM）觀察了三維培養(yǎng)聚集成團(tuán)的HDPF隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，逐漸發(fā)生細(xì)胞膜穿孔破損，球體內(nèi)細(xì)胞線粒體腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，細(xì)胞內(nèi)空泡形成，染色質(zhì)邊集，核固縮，核溶解和核碎裂等符合細(xì)胞壞死的形態(tài)學(xué)特征，此部分結(jié)果提示三維培養(yǎng)的HDPF可形成球狀聚集，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸發(fā)生細(xì)胞壞死。 2、三維培養(yǎng)HDPF發(fā)生nemosis釋放炎性因子和趨化因子的研究 發(fā)生nemosis的成纖維細(xì)胞球能分泌大量炎性因子和趨化因子，其中一個(gè)特征是誘導(dǎo)環(huán)氧合酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）表達(dá)和釋放白介素-8（Interleukin-8，IL-8）。COX-2是誘導(dǎo)花生四烯酸轉(zhuǎn)變?yōu)榍傲邢偎谽2（prostaglandin E2，PGE2）的酶，既往研究指出炎癥牙髓較正常牙髓組織COX-2表達(dá)增高，因此我們選擇研究COX-2，PGE2和IL-8作為研究HDPF發(fā)生nemosis釋放炎癥因子和趨化因子的指標(biāo)。 第二部分的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)三維培養(yǎng)的HDPF隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，炎癥因子COX-2蛋白表達(dá)逐漸增高，釋放PGE2逐漸增多，同時(shí)趨化因子IL-8的釋放逐漸增多，球體聚集后此過程不可逆轉(zhuǎn)，而普通貼壁培養(yǎng)的HDPF在培養(yǎng)期間上述因子未見明顯表達(dá)。值得注意的是在我們的三維培養(yǎng)體系中，不存在外界毒力因子，COX-2，PGE2和IL-8的高表達(dá)僅僅是由于HDPF細(xì)胞和細(xì)胞之間球狀聚集發(fā)生nemosis引起的，提示HDPF發(fā)生nemosis釋放炎癥因子和趨化因子是程序性的。 3、三維培養(yǎng)HDPF發(fā)生nemosis對(duì)人牙髓干細(xì)胞（hDPSCs）遷移的影響 長(zhǎng)期以來牙髓炎癥被認(rèn)為不利于牙髓損傷修復(fù)，然而最近的研究提示炎癥反應(yīng)可能與牙髓損傷修復(fù)中干細(xì)胞的激活有關(guān)。I.About等學(xué)者指出牙本質(zhì)-牙髓復(fù)合體損傷修復(fù)的研究不僅需要研究干細(xì)胞潛力，也需要研究牙髓中支持細(xì)和干細(xì)胞之間的相互作用。本研究第二部分研究結(jié)果表明HDPF發(fā)生nemosis可釋放一系列炎癥因子和趨化因子，提示我們可以利用nemosis模型研究HDPF和hDPSCs之間的相互作用。 因此，本研究的第三部分運(yùn)用transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)探討三維培養(yǎng)HDPF發(fā)生nemosis對(duì)hDPSCs細(xì)胞遷移的影響，發(fā)現(xiàn)三維培養(yǎng)HDPF條件培養(yǎng)液較普通貼壁培養(yǎng)HDPF能誘導(dǎo)數(shù)量更多的hDPSCs發(fā)生細(xì)胞遷移，這一結(jié)果首次揭示了nemosis對(duì)干細(xì)胞的影響，關(guān)于HDPF發(fā)生nemosis的研究可能為運(yùn)用干細(xì)胞促進(jìn)牙髓炎癥損傷修復(fù)打下實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)以及提供新的思路。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R781
【圖文】：

圖 1 細(xì)菌引發(fā)的宿主細(xì)胞死亡模式（摘自 Hiroshi,et al.[42]）細(xì)菌通過不同的模式導(dǎo)致宿主細(xì)胞死亡，包括凋亡，壞死和 pyroptosis。

圖 1 細(xì)菌引發(fā)的宿主細(xì)胞死亡模式（摘自 Hiroshi,et al.[42]）細(xì)菌通過不同的模式導(dǎo)致宿主細(xì)胞死亡，包括凋亡，壞死和 pyroptosi

第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文27圖3 發(fā)生nemosis的成纖維細(xì)胞和其他細(xì)胞之間可能的旁分泌作用圖解（摘自Antti,et al.[2]）發(fā)生 nemosis 的成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和炎癥細(xì)胞可能的相互作用

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本文編號(hào)：2776225