【摘要】： 如何構(gòu)建具有生物活性的組織工程化牙根是當前牙齒再生研究中的一個“瓶頸”問題,直接關(guān)系到牙齒組織工程的成敗和最終走向。種子細胞作為牙齒組織工程中的一個關(guān)鍵因素之一,一直是國內(nèi)外學者著力研究的熱點課題。傳統(tǒng)牙根/牙周組織工程中應用的種子細胞主要來源于成體干細胞,鑒于其不存在倫理問題,并具有可在體外操作、來源豐富、可塑性強、無免疫排斥等特點,已成為牙根/牙周組織工程中極具應用優(yōu)勢的種子細胞。但作為成體干細胞,同時也面臨著一系列問題,諸如:穩(wěn)定、可靠的細胞來源;干細胞數(shù)量少,大規(guī)模體外擴增傳代培養(yǎng)如何維持干細胞狀態(tài);如何實現(xiàn)定向誘導分化形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)等,這些缺點最終限制了牙根/牙周組織工程的發(fā)展。 然而,隨著發(fā)育組織工程學的出現(xiàn),為組織工程生物活性牙根/牙周組織的構(gòu)建提供了嶄新的思路和方法。從牙根發(fā)育早期獲得的牙根根端復合體是牙根發(fā)育的“器官始基”,由根端牙乳頭、上皮根鞘和根端牙囊三部分結(jié)構(gòu)組成,通過上皮-間充質(zhì)間的相互調(diào)控作用,具有獨立生成牙根牙周組織的能力。我們認為發(fā)育期牙根根端復合體來源的間充質(zhì)干細胞為異質(zhì)性,理論上具有形成牙根各部分,即牙髓/牙本質(zhì)復合體和牙骨質(zhì)/牙周膜/牙槽骨復合體的能力,可能作為候選種子細胞應用于牙根/牙周組織工程。因此,本研究擬對牙根發(fā)育期相關(guān)間充質(zhì)干細胞的生物學特性進行研究,探討其作為種子細胞在牙根/牙周組織工程中應用的可行性,以期為組織工程化牙根/牙周組織構(gòu)建優(yōu)選新的種子細胞。 所取得的主要研究結(jié)果如下: 1.人-牙根發(fā)育期根尖復合體來源間充質(zhì)干細胞克隆表型篩選 為了驗證牙根發(fā)育期根尖復合體來源間充質(zhì)干細胞作為組織工程化牙根/牙周復合體種子細胞的可行性,本實驗分離培養(yǎng)了人牙根發(fā)育期根尖復合體來源間充質(zhì)干細胞并進行相關(guān)生物學特性檢測;采用有限稀釋法篩選單克隆細胞,通過體內(nèi)體外分化實驗進行克隆表型鑒定,觀察不同克隆表型干細胞的牙根/牙周組織再生能力。結(jié)果顯示:牙根發(fā)育期根尖復合體來源間充質(zhì)干細胞為異質(zhì)性;具有顯著的“胚胎性”組織特征:表現(xiàn)出極高的增殖活性、克隆形成能力和體外多向分化能力;在體內(nèi)可以異位形成類牙骨質(zhì)和類牙本質(zhì)樣礦化結(jié)構(gòu)。同時從牙根發(fā)育期根尖復合體來源間充質(zhì)干細胞中成功篩選出成骨和成纖維兩種單克隆細胞表型,其中成骨表型單克隆細胞的體外礦化能力顯著強于成纖維表型單克隆細胞,并在體內(nèi)異位形成均質(zhì)樣礦化結(jié)構(gòu),而成纖維表型單克隆細胞則形成纖維結(jié)締組織樣結(jié)構(gòu)。 本研究結(jié)果說明,牙根發(fā)育期根尖復合體來源間充質(zhì)干細胞可以作為牙根/牙周組織工程中的種子細胞,不同表型的克隆細胞具有形成特定牙體結(jié)構(gòu)的潛力,將不同表型克隆重組以構(gòu)建完整生物活性牙根/牙周組織結(jié)構(gòu)在理論上具有可行性。 2.人-牙根發(fā)育期根端牙囊干細胞生物學特性研究 為了評估牙根發(fā)育期根端牙囊干細胞作為組織工程化牙周復合體種子細胞的可行性,本實驗以人成體牙周膜干細胞為對照,分離培養(yǎng)了人牙根發(fā)育期根端牙囊干細胞,進行體外生物學特性檢測,并觀察其形成牙周組織的能力;通過體外培養(yǎng),觀察長期傳代對其干細胞生物學性狀的影響。結(jié)果顯示:從牙根發(fā)育期獲得的根端牙囊干細胞與成體組織來源的牙周膜干細胞相比,在組織學、細胞學及分子生物學等方面存在一系列的差異:在體外具有更強的干細胞特性(增殖活性、克隆形成能力、多向分化能力);在體內(nèi)可以異位形成類牙骨質(zhì)/牙周膜樣復合體結(jié)構(gòu)。經(jīng)過長期傳代,根端牙囊干細胞的細胞形態(tài)學發(fā)生變化,并逐漸喪失其干細胞生物學特性,同時伴有ALP、成骨相關(guān)基因表達降低以及體內(nèi)組織再生能力喪失。 本研究結(jié)果說明,從牙根發(fā)育期獲得的根端牙囊干細胞完全區(qū)別于成體組織來源的牙周膜干細胞,是一種新型的發(fā)育期組織來源間充質(zhì)干細胞�？梢宰鳛橐环N新的候選種子細胞應用于牙周再生組織工程。在牙組織工程研究中,種子細胞應避免長期傳代導致干細胞生物學性狀發(fā)生變化。
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R78
【圖文】：

圖1.3 DAC-MSCs細胞周期期外，處于靜止狀態(tài)時期；G1 期：DNA 合成前 合成期；G2 期：DNA 合成后期；M 期：有絲分細胞生物學特性鑒定測的結(jié)果表明，16.1%的DAC-MSCs Stro-1 表D146 表達陽性(圖1.4 A,B)。Stro-1 和CD14面標記物，說明獲得的DAC-MSCs 為間充質(zhì)一樣，人DAC-MSCs具有很強的克隆形成能SCs 呈集落樣生長，細胞形態(tài)多為長梭形類色顯示，DAC-MSCs 的克隆形成率約78向分化潛能，我們分別對多克隆來源的DAC結(jié)果顯示茜素紅和油紅O 染色均為陽性(圖1

圖1.4 DAC-MSCs間充質(zhì)干細胞表面分子標志物表達A： Stro-1 陽性率為16.1%；B：CD146 陽性率為89.4%2.4 DAC間充質(zhì)干細胞基因表達PCR 檢測結(jié)果顯示， DAC-MSCs 表達 COL1 、 OCN 、 BSP 、 ALPmRNA(圖1.7)。一般來說，BSP、OCN mRNA 多表達于成牙骨質(zhì)/成骨細胞[126, 127]。綜合mRNA 表達的情況，我們認為DAC-MSCs 部分呈現(xiàn)出成牙本質(zhì)細胞和成牙骨質(zhì)細胞的基因表型。

第四軍醫(yī)大學博士學位論文次數(shù)的增加，細胞形態(tài)發(fā)生變化，表現(xiàn)為體積變長的梭形成纖維樣。PDLSCs隨著傳代次數(shù)的增加也表現(xiàn)出類似的形態(tài)學改變，細胞體變細（圖3.2 A-D）。 細胞遷移及增殖能力分析為評估細胞的遷移能力，我們對第三代的PAFSCs和PDLSCs進行實驗。24小時后，在進行了劃痕處理的地方，PAFSCs的遷移距離明LSCs遠(P< 0.05)，表現(xiàn)出更強的遷移能力（圖3.3 A-C）。為評估細胞的增殖能力，進行了細胞生長曲線的繪制及BrdU陽性。如圖3.4，圖3.5所示，第三代的PAFSCs較同代數(shù)的PDLSC表現(xiàn)出增殖活性(P< 0.05)，但在第二十代，PAFSCs和PDLSCs的增殖速率均降(P< 0.05)，甚至于細胞接近停止分裂。

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 郭紅延,吳補領(lǐng),郭希民,楊成,徐蓬,王常勇;重建牙本質(zhì)-牙髓復合體樣結(jié)構(gòu)的實驗研究[J];中華口腔醫(yī)學雜志;2005年06期

本文編號：2774774