【摘要】： 如何構(gòu)建具有生物活性的組織工程化牙根是當(dāng)前牙齒再生研究中的一個(gè)“瓶頸”問題,直接關(guān)系到牙齒組織工程的成敗和最終走向。種子細(xì)胞作為牙齒組織工程中的一個(gè)關(guān)鍵因素之一,一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者著力研究的熱點(diǎn)課題。傳統(tǒng)牙根/牙周組織工程中應(yīng)用的種子細(xì)胞主要來源于成體干細(xì)胞,鑒于其不存在倫理問題,并具有可在體外操作、來源豐富、可塑性強(qiáng)、無(wú)免疫排斥等特點(diǎn),已成為牙根/牙周組織工程中極具應(yīng)用優(yōu)勢(shì)的種子細(xì)胞。但作為成體干細(xì)胞,同時(shí)也面臨著一系列問題,諸如:穩(wěn)定、可靠的細(xì)胞來源;干細(xì)胞數(shù)量少,大規(guī)模體外擴(kuò)增傳代培養(yǎng)如何維持干細(xì)胞狀態(tài);如何實(shí)現(xiàn)定向誘導(dǎo)分化形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)等,這些缺點(diǎn)最終限制了牙根/牙周組織工程的發(fā)展。 然而,隨著發(fā)育組織工程學(xué)的出現(xiàn),為組織工程生物活性牙根/牙周組織的構(gòu)建提供了嶄新的思路和方法。從牙根發(fā)育早期獲得的牙根根端復(fù)合體是牙根發(fā)育的“器官始基”,由根端牙乳頭、上皮根鞘和根端牙囊三部分結(jié)構(gòu)組成,通過上皮-間充質(zhì)間的相互調(diào)控作用,具有獨(dú)立生成牙根牙周組織的能力。我們認(rèn)為發(fā)育期牙根根端復(fù)合體來源的間充質(zhì)干細(xì)胞為異質(zhì)性,理論上具有形成牙根各部分,即牙髓/牙本質(zhì)復(fù)合體和牙骨質(zhì)/牙周膜/牙槽骨復(fù)合體的能力,可能作為候選種子細(xì)胞應(yīng)用于牙根/牙周組織工程。因此,本研究擬對(duì)牙根發(fā)育期相關(guān)間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性進(jìn)行研究,探討其作為種子細(xì)胞在牙根/牙周組織工程中應(yīng)用的可行性,以期為組織工程化牙根/牙周組織構(gòu)建優(yōu)選新的種子細(xì)胞。 所取得的主要研究結(jié)果如下: 1.人-牙根發(fā)育期根尖復(fù)合體來源間充質(zhì)干細(xì)胞克隆表型篩選 為了驗(yàn)證牙根發(fā)育期根尖復(fù)合體來源間充質(zhì)干細(xì)胞作為組織工程化牙根/牙周復(fù)合體種子細(xì)胞的可行性,本實(shí)驗(yàn)分離培養(yǎng)了人牙根發(fā)育期根尖復(fù)合體來源間充質(zhì)干細(xì)胞并進(jìn)行相關(guān)生物學(xué)特性檢測(cè);采用有限稀釋法篩選單克隆細(xì)胞,通過體內(nèi)體外分化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行克隆表型鑒定,觀察不同克隆表型干細(xì)胞的牙根/牙周組織再生能力。結(jié)果顯示:牙根發(fā)育期根尖復(fù)合體來源間充質(zhì)干細(xì)胞為異質(zhì)性;具有顯著的“胚胎性”組織特征:表現(xiàn)出極高的增殖活性、克隆形成能力和體外多向分化能力;在體內(nèi)可以異位形成類牙骨質(zhì)和類牙本質(zhì)樣礦化結(jié)構(gòu)。同時(shí)從牙根發(fā)育期根尖復(fù)合體來源間充質(zhì)干細(xì)胞中成功篩選出成骨和成纖維兩種單克隆細(xì)胞表型,其中成骨表型單克隆細(xì)胞的體外礦化能力顯著強(qiáng)于成纖維表型單克隆細(xì)胞,并在體內(nèi)異位形成均質(zhì)樣礦化結(jié)構(gòu),而成纖維表型單克隆細(xì)胞則形成纖維結(jié)締組織樣結(jié)構(gòu)。 本研究結(jié)果說明,牙根發(fā)育期根尖復(fù)合體來源間充質(zhì)干細(xì)胞可以作為牙根/牙周組織工程中的種子細(xì)胞,不同表型的克隆細(xì)胞具有形成特定牙體結(jié)構(gòu)的潛力,將不同表型克隆重組以構(gòu)建完整生物活性牙根/牙周組織結(jié)構(gòu)在理論上具有可行性。 2.人-牙根發(fā)育期根端牙囊干細(xì)胞生物學(xué)特性研究 為了評(píng)估牙根發(fā)育期根端牙囊干細(xì)胞作為組織工程化牙周復(fù)合體種子細(xì)胞的可行性,本實(shí)驗(yàn)以人成體牙周膜干細(xì)胞為對(duì)照,分離培養(yǎng)了人牙根發(fā)育期根端牙囊干細(xì)胞,進(jìn)行體外生物學(xué)特性檢測(cè),并觀察其形成牙周組織的能力;通過體外培養(yǎng),觀察長(zhǎng)期傳代對(duì)其干細(xì)胞生物學(xué)性狀的影響。結(jié)果顯示:從牙根發(fā)育期獲得的根端牙囊干細(xì)胞與成體組織來源的牙周膜干細(xì)胞相比,在組織學(xué)、細(xì)胞學(xué)及分子生物學(xué)等方面存在一系列的差異:在體外具有更強(qiáng)的干細(xì)胞特性(增殖活性、克隆形成能力、多向分化能力);在體內(nèi)可以異位形成類牙骨質(zhì)/牙周膜樣復(fù)合體結(jié)構(gòu)。經(jīng)過長(zhǎng)期傳代,根端牙囊干細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)學(xué)發(fā)生變化,并逐漸喪失其干細(xì)胞生物學(xué)特性,同時(shí)伴有ALP、成骨相關(guān)基因表達(dá)降低以及體內(nèi)組織再生能力喪失。 本研究結(jié)果說明,從牙根發(fā)育期獲得的根端牙囊干細(xì)胞完全區(qū)別于成體組織來源的牙周膜干細(xì)胞,是一種新型的發(fā)育期組織來源間充質(zhì)干細(xì)胞。可以作為一種新的候選種子細(xì)胞應(yīng)用于牙周再生組織工程。在牙組織工程研究中,種子細(xì)胞應(yīng)避免長(zhǎng)期傳代導(dǎo)致干細(xì)胞生物學(xué)性狀發(fā)生變化。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R78
【圖文】：

圖1.3 DAC-MSCs細(xì)胞周期期外，處于靜止?fàn)顟B(tài)時(shí)期；G1 期：DNA 合成前 合成期；G2 期：DNA 合成后期；M 期：有絲分細(xì)胞生物學(xué)特性鑒定測(cè)的結(jié)果表明，16.1%的DAC-MSCs Stro-1 表D146 表達(dá)陽(yáng)性(圖1.4 A,B)。Stro-1 和CD14面標(biāo)記物，說明獲得的DAC-MSCs 為間充質(zhì)一樣，人DAC-MSCs具有很強(qiáng)的克隆形成能SCs 呈集落樣生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)多為長(zhǎng)梭形類色顯示，DAC-MSCs 的克隆形成率約78向分化潛能，我們分別對(duì)多克隆來源的DAC結(jié)果顯示茜素紅和油紅O 染色均為陽(yáng)性(圖1

圖1.4 DAC-MSCs間充質(zhì)干細(xì)胞表面分子標(biāo)志物表達(dá)A： Stro-1 陽(yáng)性率為16.1%；B：CD146 陽(yáng)性率為89.4%2.4 DAC間充質(zhì)干細(xì)胞基因表達(dá)PCR 檢測(cè)結(jié)果顯示， DAC-MSCs 表達(dá) COL1 、 OCN 、 BSP 、 ALPmRNA(圖1.7)。一般來說，BSP、OCN mRNA 多表達(dá)于成牙骨質(zhì)/成骨細(xì)胞[126, 127]。綜合mRNA 表達(dá)的情況，我們認(rèn)為DAC-MSCs 部分呈現(xiàn)出成牙本質(zhì)細(xì)胞和成牙骨質(zhì)細(xì)胞的基因表型。

第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文次數(shù)的增加，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，表現(xiàn)為體積變長(zhǎng)的梭形成纖維樣。PDLSCs隨著傳代次數(shù)的增加也表現(xiàn)出類似的形態(tài)學(xué)改變，細(xì)胞體變細(xì)（圖3.2 A-D）。 細(xì)胞遷移及增殖能力分析為評(píng)估細(xì)胞的遷移能力，我們對(duì)第三代的PAFSCs和PDLSCs進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。24小時(shí)后，在進(jìn)行了劃痕處理的地方，PAFSCs的遷移距離明LSCs遠(yuǎn)(P< 0.05)，表現(xiàn)出更強(qiáng)的遷移能力（圖3.3 A-C）。為評(píng)估細(xì)胞的增殖能力，進(jìn)行了細(xì)胞生長(zhǎng)曲線的繪制及BrdU陽(yáng)性。如圖3.4，圖3.5所示，第三代的PAFSCs較同代數(shù)的PDLSC表現(xiàn)出增殖活性(P< 0.05)，但在第二十代，PAFSCs和PDLSCs的增殖速率均降(P< 0.05)，甚至于細(xì)胞接近停止分裂。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 郭紅延,吳補(bǔ)領(lǐng),郭希民,楊成,徐蓬,王常勇;重建牙本質(zhì)-牙髓復(fù)合體樣結(jié)構(gòu)的實(shí)驗(yàn)研究[J];中華口腔醫(yī)學(xué)雜志;2005年06期

本文編號(hào)：2774774