【摘要】：一直以來,牙周組織再生(包括軟硬組織的再生),是一個具有挑戰(zhàn)性的問題。組織工程技術在牙周再生領域的應用成為近年來關注的熱點。種子細胞的來源,是組織工程成功與否的關鍵。已有研究表明牙根表面的牙周膜中有干細胞(periodontal ligament stem cells derived from root surface, r-PDLSCs)的存在,在體內(nèi)可以生成牙骨質(zhì)/牙周膜樣組織,可以促進牙周組織的再生。牙周膜細胞是一個異質(zhì)性細胞群,牙周膜干細胞有可能由于存在部位的不同而存在性質(zhì)上的差異。本實驗從牙槽窩表面的牙周膜中分離出牙周膜干細胞(periodontal ligament stem cells derived from alveolar bone surface, a-PDLSCs),對其干細胞生物學特性及牙周再生方面的應用做了一系列分析,通過與牙根表面牙周膜干細胞和骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)作比較,分析了兩部分來源牙周膜干細胞性質(zhì)的差異。為牙周再生中,牙周膜干細胞的應用開辟了思路。主要研究成果如下: 第一部分:牙槽窩來源牙周膜干細胞的分離培養(yǎng)及生物學特性鑒定 為了證明拔牙后牙槽窩中牙周膜的存在,模擬正常拔牙程序拔除SD大鼠磨牙,通過HE染色對拔牙后牙槽窩及牙根面進行組織學觀察,結果顯示牙拔除術后,牙根表面和牙槽窩表面都粘附有牙周膜組織。通過在SD大鼠體內(nèi)原位標記BrdU,通過免疫熒光實驗檢測牙周膜中干細胞對BrdU的長期吸附能力。結果顯示干細胞在牙周膜中的分布具有不對稱性,靠近牙槽窩側的牙周膜干細胞要多于牙根表面?zhèn)�。通過酶消化聯(lián)合組織塊培養(yǎng)法成功的從拔牙后人牙槽窩表面牙周膜中分離出了干細胞。通過克隆形成率分析、MTT分析、流式細胞周期分析對牙槽窩來源牙周膜干細胞的增殖能力進行鑒定,結果顯示,牙槽窩來源牙周膜干細胞和牙根表面來源牙周膜干細胞的增殖能力相似,都強于骨髓間充質(zhì)干細胞。通過流式細胞儀對表面抗原進行檢測,發(fā)現(xiàn)牙槽窩來源牙周膜干細胞陽性表達間充質(zhì)干細胞表面標記,陰性表達造血系來源細胞的表面標記。通過免疫熒光技術發(fā)現(xiàn)a-PDLSCs陽性表達成骨相關基因COLⅠ和OCN。堿性磷酸酶活性的檢測結果顯示,a-PDLSCs對堿性磷酸酶的表達要高于r-PDLSCs。通過Real-time PCR技術從RNA水平對成骨及韌帶組織相關基因進行定量分析,結果顯示,a-PDLSCs對于礦化相關基因的表達都高于r-PDLSCs;對于韌帶組織相關基因Scleraxis的表達,牙周膜干細胞要低于BMSCs。 以上結果證明牙槽骨表面來源的牙周膜中確實存在干細胞,且這種干細胞具備高增殖能力,和相對于r-PDLSCs更強的礦化潛能。a-PDLSCs可以作為種子細胞應用于牙周再生的研究中。 第二部分牙槽窩來源牙周膜干細胞分化潛能及牙周再生中應用的研究 本實驗分別在成骨誘導、成脂誘導、非誘導條件下,觀察r-PDLSCs、a-PDLSCs、BMSCs三種干細胞分化能力的強弱,結果顯示三種干細胞都形成了礦化結節(jié)或脂肪小滴,而定量分析結果顯示,在成骨/成脂分化能力方面,a-PDLSCs要強于r-PDLSCs。將三種干細胞與CBB復合包裹纖維蛋白膠,植入裸鼠背部皮下,6周后組織學對移植物進行觀察,結果顯示,r-PDLSCs和a-PDLSCs的移植物均生成了牙周膜樣組織和礦化組織,然而礦化組織的形態(tài)和面積存在差別。a-PDLSCs形成礦化組織的面積明顯大于r-PDLSCs,且礦化組織的形態(tài)近似于BMSCs的生成物。為了進一步評價干細胞的礦化能力和骨修復能力,本實驗在裸鼠顱骨人工創(chuàng)造了極限骨缺損,觀察牙周膜干細胞植入后骨缺損修復的情況。Micro-CT結果顯示,r-PDLSCs組和a-PDLSCs組都在缺損區(qū)形成了新骨,然而定量分析結果顯示,a-PDLSCs形成新骨的面積要大于r-PDLSCs,說明a-PDLSCs具備更強的骨缺損修復能力。 以上結果從分化能力及再生修復能力證明了a-PDLSCs的特性。a-PDLSCs相對于r-PDLSCs更強的分化能力和骨再生修復能力為其在牙周組織工程中的應用奠定了基礎。
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R78
【圖文】：

牙周膜（PDL）一部分附著于牙根（R）表面（圖1A）；另一部分附著于牙槽窩內(nèi)（AS），牙槽骨（AB）表面(圖 1B)。Bar=2mm圖 2 牙周膜中干細胞的分布。牙周膜中干細胞對 BrdU 的長期吸附能力檢測結果顯示，近牙槽骨（A）側牙周膜（PDL）中的 BrdU 陽性細胞（三角）要明顯多于牙根（R）側的陽性細胞（箭頭）。Bar=500 μm.相關博士學位論文 2011年 第12期 醫(yī)藥衛(wèi)生科技輯 E074-1-74

77圖 2 牙周膜中干細胞的分布。牙周膜中干細胞對 BrdU 的長期吸附能力檢測結果顯示近牙槽骨（A）側牙周膜（PDL）中的 BrdU 陽性細胞（三角）要明顯多于牙根（R側的陽性細胞（箭頭）。Bar=500 μm.

圖 3 形態(tài)學特征。倒置相差顯微鏡下觀察，r-PDLSCs（A）、a-PDLSCs（B）、BMSCs（C）大部分呈現(xiàn)間充質(zhì)干細胞的長梭形形態(tài)，少數(shù)細胞呈現(xiàn)多角形或橢圓形。Bar=100 μm

【參考文獻】

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本文編號：2751900