【摘要】：一直以來,牙周組織再生(包括軟硬組織的再生),是一個(gè)具有挑戰(zhàn)性的問題。組織工程技術(shù)在牙周再生領(lǐng)域的應(yīng)用成為近年來關(guān)注的熱點(diǎn)。種子細(xì)胞的來源,是組織工程成功與否的關(guān)鍵。已有研究表明牙根表面的牙周膜中有干細(xì)胞(periodontal ligament stem cells derived from root surface, r-PDLSCs)的存在,在體內(nèi)可以生成牙骨質(zhì)/牙周膜樣組織,可以促進(jìn)牙周組織的再生。牙周膜細(xì)胞是一個(gè)異質(zhì)性細(xì)胞群,牙周膜干細(xì)胞有可能由于存在部位的不同而存在性質(zhì)上的差異。本實(shí)驗(yàn)從牙槽窩表面的牙周膜中分離出牙周膜干細(xì)胞(periodontal ligament stem cells derived from alveolar bone surface, a-PDLSCs),對其干細(xì)胞生物學(xué)特性及牙周再生方面的應(yīng)用做了一系列分析,通過與牙根表面牙周膜干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)作比較,分析了兩部分來源牙周膜干細(xì)胞性質(zhì)的差異。為牙周再生中,牙周膜干細(xì)胞的應(yīng)用開辟了思路。主要研究成果如下: 第一部分:牙槽窩來源牙周膜干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及生物學(xué)特性鑒定 為了證明拔牙后牙槽窩中牙周膜的存在,模擬正常拔牙程序拔除SD大鼠磨牙,通過HE染色對拔牙后牙槽窩及牙根面進(jìn)行組織學(xué)觀察,結(jié)果顯示牙拔除術(shù)后,牙根表面和牙槽窩表面都粘附有牙周膜組織。通過在SD大鼠體內(nèi)原位標(biāo)記BrdU,通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測牙周膜中干細(xì)胞對BrdU的長期吸附能力。結(jié)果顯示干細(xì)胞在牙周膜中的分布具有不對稱性,靠近牙槽窩側(cè)的牙周膜干細(xì)胞要多于牙根表面?zhèn)�。通過酶消化聯(lián)合組織塊培養(yǎng)法成功的從拔牙后人牙槽窩表面牙周膜中分離出了干細(xì)胞。通過克隆形成率分析、MTT分析、流式細(xì)胞周期分析對牙槽窩來源牙周膜干細(xì)胞的增殖能力進(jìn)行鑒定,結(jié)果顯示,牙槽窩來源牙周膜干細(xì)胞和牙根表面來源牙周膜干細(xì)胞的增殖能力相似,都強(qiáng)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞。通過流式細(xì)胞儀對表面抗原進(jìn)行檢測,發(fā)現(xiàn)牙槽窩來源牙周膜干細(xì)胞陽性表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記,陰性表達(dá)造血系來源細(xì)胞的表面標(biāo)記。通過免疫熒光技術(shù)發(fā)現(xiàn)a-PDLSCs陽性表達(dá)成骨相關(guān)基因COLⅠ和OCN。堿性磷酸酶活性的檢測結(jié)果顯示,a-PDLSCs對堿性磷酸酶的表達(dá)要高于r-PDLSCs。通過Real-time PCR技術(shù)從RNA水平對成骨及韌帶組織相關(guān)基因進(jìn)行定量分析,結(jié)果顯示,a-PDLSCs對于礦化相關(guān)基因的表達(dá)都高于r-PDLSCs;對于韌帶組織相關(guān)基因Scleraxis的表達(dá),牙周膜干細(xì)胞要低于BMSCs。 以上結(jié)果證明牙槽骨表面來源的牙周膜中確實(shí)存在干細(xì)胞,且這種干細(xì)胞具備高增殖能力,和相對于r-PDLSCs更強(qiáng)的礦化潛能。a-PDLSCs可以作為種子細(xì)胞應(yīng)用于牙周再生的研究中。 第二部分牙槽窩來源牙周膜干細(xì)胞分化潛能及牙周再生中應(yīng)用的研究 本實(shí)驗(yàn)分別在成骨誘導(dǎo)、成脂誘導(dǎo)、非誘導(dǎo)條件下,觀察r-PDLSCs、a-PDLSCs、BMSCs三種干細(xì)胞分化能力的強(qiáng)弱,結(jié)果顯示三種干細(xì)胞都形成了礦化結(jié)節(jié)或脂肪小滴,而定量分析結(jié)果顯示,在成骨/成脂分化能力方面,a-PDLSCs要強(qiáng)于r-PDLSCs。將三種干細(xì)胞與CBB復(fù)合包裹纖維蛋白膠,植入裸鼠背部皮下,6周后組織學(xué)對移植物進(jìn)行觀察,結(jié)果顯示,r-PDLSCs和a-PDLSCs的移植物均生成了牙周膜樣組織和礦化組織,然而礦化組織的形態(tài)和面積存在差別。a-PDLSCs形成礦化組織的面積明顯大于r-PDLSCs,且礦化組織的形態(tài)近似于BMSCs的生成物。為了進(jìn)一步評價(jià)干細(xì)胞的礦化能力和骨修復(fù)能力,本實(shí)驗(yàn)在裸鼠顱骨人工創(chuàng)造了極限骨缺損,觀察牙周膜干細(xì)胞植入后骨缺損修復(fù)的情況。Micro-CT結(jié)果顯示,r-PDLSCs組和a-PDLSCs組都在缺損區(qū)形成了新骨,然而定量分析結(jié)果顯示,a-PDLSCs形成新骨的面積要大于r-PDLSCs,說明a-PDLSCs具備更強(qiáng)的骨缺損修復(fù)能力。 以上結(jié)果從分化能力及再生修復(fù)能力證明了a-PDLSCs的特性。a-PDLSCs相對于r-PDLSCs更強(qiáng)的分化能力和骨再生修復(fù)能力為其在牙周組織工程中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R78
【圖文】：

牙周膜（PDL）一部分附著于牙根（R）表面（圖1A）；另一部分附著于牙槽窩內(nèi)（AS），牙槽骨（AB）表面(圖 1B)。Bar=2mm圖 2 牙周膜中干細(xì)胞的分布。牙周膜中干細(xì)胞對 BrdU 的長期吸附能力檢測結(jié)果顯示，近牙槽骨（A）側(cè)牙周膜（PDL）中的 BrdU 陽性細(xì)胞（三角）要明顯多于牙根（R）側(cè)的陽性細(xì)胞（箭頭）。Bar=500 μm.相關(guān)博士學(xué)位論文 2011年 第12期 醫(yī)藥衛(wèi)生科技輯 E074-1-74

77圖 2 牙周膜中干細(xì)胞的分布。牙周膜中干細(xì)胞對 BrdU 的長期吸附能力檢測結(jié)果顯示近牙槽骨（A）側(cè)牙周膜（PDL）中的 BrdU 陽性細(xì)胞（三角）要明顯多于牙根（R側(cè)的陽性細(xì)胞（箭頭）。Bar=500 μm.

圖 3 形態(tài)學(xué)特征。倒置相差顯微鏡下觀察，r-PDLSCs（A）、a-PDLSCs（B）、BMSCs（C）大部分呈現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞的長梭形形態(tài)，少數(shù)細(xì)胞呈現(xiàn)多角形或橢圓形。Bar=100 μm

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2751900