【摘要】：雌激素是人體重要的性激素，研究表明雌激素可以調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖及分化能力，如雌激素缺乏狀態(tài)的大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（rat bone marrowmeschymal stem cells，rBMMSCs）、牙周膜干細(xì)胞（periodontal ligament stemcells，PDLSCs）增殖能力及成骨能力下降，相反，經(jīng)雌激素刺激后，大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨能力升高。目前，雌激素對牙髓干細(xì)胞(dental pulp stem cells，DPSCs)的成牙及成骨能力影響尚未有文獻(xiàn)報(bào)道。 第一部分雌激素缺乏大鼠模型的建立及細(xì)胞增殖能力檢測 研究目的：建立雌激素缺乏大鼠模型，分離培養(yǎng)牙髓干細(xì)胞，檢測其增殖能力。 研究方法：30只八周齡雌性SD大鼠，隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham）及卵巢去勢組（OVX）。手術(shù)后一個(gè)月，分離兩組大鼠上下頜切牙及牙髓，酶消化法及有限稀釋法分離培養(yǎng)多克隆來源的牙髓干細(xì)胞，α-MEM培養(yǎng),細(xì)胞角蛋白（CK）、波形絲蛋白(Vimentin)和Stro-1免疫細(xì)胞化學(xué)染色驗(yàn)證其間質(zhì)干細(xì)胞特性。采用四甲基偶氮噻唑鹽（MTT）法繪制兩組細(xì)胞生長曲線，流式細(xì)胞術(shù)（FCM）檢測細(xì)胞周期分布，計(jì)算細(xì)胞增殖指數(shù)（PI），檢測雌激素缺乏對DPSCs增殖能力的影響。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：OVX組大鼠體重較Sham組顯著增加，體內(nèi)雌激素水平較Sham組降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P 0.05)。兩組細(xì)胞呈CK染色陰性，Vimentin，Stro-1染色陽性。MTT及FCM結(jié)果顯示Sham-DPSCs及OVX-DPSCs增殖能力沒有顯著差異。 結(jié)論：卵巢去勢一個(gè)月，可成功建立雌激素缺乏大鼠模型。經(jīng)鑒定，分離出的多克隆牙髓細(xì)胞為間充質(zhì)來源干細(xì)胞，雌激素缺乏狀態(tài)對其增殖能力沒有顯著影響。 第二部分雌激素缺乏對大鼠牙髓干細(xì)胞成牙、成骨向分化能力的影響 研究目的：明確雌激素缺乏對大鼠牙髓干細(xì)胞成牙/成骨向分化能力的影響。 研究方法：檢測兩組細(xì)胞在常規(guī)培養(yǎng)液及成骨誘導(dǎo)液中培養(yǎng)3天時(shí)堿性磷酸酶（ALP）活性，茜素紅染色檢測成骨誘導(dǎo)液誘導(dǎo)兩組細(xì)胞14天時(shí)的鈣結(jié)節(jié)形成情況，提取兩組細(xì)胞總RNA和總蛋白，實(shí)時(shí)定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)實(shí)驗(yàn)（Real-time RT-PCR）檢測牙向/骨向分化相關(guān)基因（Alp、Runx2、Ocn、Osx和Dspp等）的表達(dá)情況，蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)（Western blot）檢測牙向/骨向分化相關(guān)蛋白（RUNX2、OSX、OCN、DSP等）的表達(dá)情況。將細(xì)胞團(tuán)體內(nèi)移植后，通過蘇木素伊紅染色及免疫組織化學(xué)染色檢測分析體內(nèi)形成的移植物，通過以上實(shí)驗(yàn)來評價(jià)雌激素缺乏狀態(tài)下大鼠牙髓干細(xì)胞的成牙/成骨向分化能力。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果：在成骨培養(yǎng)液條件下，OVX-DPSCs的ALP活性、礦化結(jié)節(jié)形成量均較Sham-DPSCs少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 0.05），OVX-DPSCs成牙/成骨向分化標(biāo)志基因及蛋白表達(dá)（Alp、Runx2/RUNX2、Osx/OSX、Ocn/OCN和Dspp/DSP）均較Sham-DPSCs低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 0.05）。體內(nèi)移植物免疫組化結(jié)果顯示OVX-DPSCs成牙（DSP）、成骨(OCN)標(biāo)志蛋白表達(dá)均較Sham-DPSCs弱。 結(jié)論：與正常大鼠DPSCs相比，雌激素缺乏狀態(tài)下的DPSCs成牙、成骨能力明顯下調(diào)。 第三部分雌激素缺乏調(diào)控DPSCs分化的NF-κB通路機(jī)制研究 研究目的：探討核因子κB（NF-κB）通路在雌激素缺乏調(diào)控DPSCs分化過程中的可能作用。 研究方法：酶聯(lián)免疫分析法（ELISA）檢測兩種細(xì)胞培養(yǎng)上清中腫瘤壞死因子α（TNF-α）的濃度，提取第三代Sham-DPSCs及OVX-DPSCs的胞蛋白及核蛋白，檢測NF-κB通路相關(guān)蛋白（IκBα、P-IκBα、P65、P-P65）的表達(dá)情況，檢測NF-κB通路抑制劑（BMS345541）對OVX-DPSCs的ALP活性、成牙成骨向分化（Alp、Runx2/RUNX2、Osx/OSX、Dspp/DSP）基因及蛋白的影響。研究結(jié)果：OVX-DPSCs上清中TNF-α濃度較Sham-DPSCs高（P 0.05），OVX-DPSCs胞漿中P-IκBα、P-P65表達(dá)較Sham-DPSCs高，且胞核中P65表達(dá)也較Sham-DPSCs高。經(jīng)BMS345541刺激后，OVX-DPSCs的ALP活性，成牙成骨向分化相關(guān)（Alp、Runx2/RUNX2、Osx/OSX、Dspp/DSP）基因及蛋白的表達(dá)均顯著上升，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P 0.05）。 結(jié)論：NF-κB通路在雌激素缺乏調(diào)控DPSCs分化過程中發(fā)揮重要作用， NF-κB通路抑制劑可以部分緩解或糾正由雌激素缺乏引起的DPSCs分化能力下降的問題。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R78
【圖文】：

圖 1.1 兩組大鼠血清雌二醇檢測及體重（A）卵巢去勢一個(gè)月，大鼠血清雌二醇明顯降低（P < 0.01）。（B）卵巢去勢一個(gè)月后，OVX 組大鼠體重較 Sham 組重（P < 0.01）。2.2 細(xì)胞培養(yǎng)兩組細(xì)胞在鏡下均為貼壁生長，形態(tài)較為均一，呈梭形、紡錘形，生長呈旋渦狀、纖維樣或放射狀，成纖維細(xì)胞樣結(jié)構(gòu)，極性排布。兩組細(xì)胞形態(tài)無明顯差異（圖 1.2）。

圖 1.1 兩組大鼠血清雌二醇檢測及體重（A）卵巢去勢一個(gè)月，大鼠血清雌二醇明顯降低（P < 0.01）。（B）卵巢去勢一個(gè)月后，OVX 組大鼠體重較 Sham 組重（P < 0.01）。2.2 細(xì)胞培養(yǎng)兩組細(xì)胞在鏡下均為貼壁生長，形態(tài)較為均一，呈梭形、紡錘形，生長呈旋渦狀、纖維樣或放射狀，成纖維細(xì)胞樣結(jié)構(gòu)，極性排布。兩組細(xì)胞形態(tài)無明顯差異（圖 1.2）。

抗 Stro-1 免疫細(xì)胞化學(xué)染色為陽性（圖1.3C，G），PBS 組為陰性對照（圖 1.3D，F(xiàn)），驗(yàn)證其間質(zhì)干細(xì)胞特性。圖 1.3 兩組細(xì)胞抗 CK，Vimentin 及 Stro-1 細(xì)胞化學(xué)染色（A） Sham-DPSCs 抗 CK 染色陰性；（B） Sham-DPSCs 抗 Vimentin 染色陽性；（C）Sham-DPSCs 抗 Stro-1 染色陽性；（D）PBS 組為陰性對照；（E）OVX-DPSCs抗 CK 染色陰性；（F）OVX-DPSCs 抗 Vimentin 染色陽性；（G）OVX-DPSCs抗 Stro-1 染色陽性；（H）PBS 組為陰性對照，400 倍鏡下，標(biāo)尺為 100μm。2.4 兩組細(xì)胞 MTT 生長曲線MTT 繪制兩組細(xì)胞生長曲線發(fā)現(xiàn)

【參考文獻(xiàn)】

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1 程敏;程琳;馮志遠(yuǎn);李廣義;;骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2在牙發(fā)育各階段中的表達(dá)[J];國際口腔醫(yī)學(xué)雜志;2009年06期

2 左熾健;剌婷;張寧;戴\戎;張曉玲;;MSCs成骨分化中BMP2對成骨轉(zhuǎn)錄因子SATB2表達(dá)的調(diào)控作用[J];上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2011年12期

3 潘秋輝;李益廣;楊松海;馬紀(jì);謝在春;于永春;孫奮勇;;骨形態(tài)發(fā)生蛋白2通過Smad途徑上調(diào)Osterix的表達(dá)[J];中國生物化學(xué)與分子生物學(xué)報(bào);2008年01期

本文編號：2750871