【摘要】： 干細(xì)胞(stem cell)是一種具有多向分化潛能和自我復(fù)制功能的未分化細(xì)胞，在特定的條件下，可以分化為不同的功能細(xì)胞，形成多種組織和器官。胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cell，ES)的分化和增殖構(gòu)成個(gè)體發(fā)育的基礎(chǔ)；而成體干細(xì)胞(adult stem cell，AS)的進(jìn)一步分化則是成體組織、器官修復(fù)再生的基礎(chǔ)。研究干細(xì)胞一方面可以揭示許多有關(guān)生長(zhǎng)發(fā)育的基礎(chǔ)理論難題，另一方面則可用于臨床治療—細(xì)胞移植治療各種疾病和構(gòu)建人工組織或器官。體外定向分化是干細(xì)胞研究和應(yīng)用的關(guān)鍵，也是生命科學(xué)領(lǐng)域的世界性難題。 起源于顱神經(jīng)嵴的面突外胚間充質(zhì)干細(xì)胞(ecto-mesenchymal stem cell，EMSC)是胚胎頜面發(fā)育過(guò)程中的暫時(shí)性結(jié)構(gòu)，具有向多種細(xì)胞分化的潛能，可以分化為成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、牙乳頭細(xì)胞、雪旺氏細(xì)胞、聽(tīng)神經(jīng)節(jié)等，并將形成上下頜骨、顳下頜關(guān)節(jié)軟骨、牙本質(zhì)、牙骨質(zhì)、牙周膜等組織器官，是多能干細(xì)胞。作為頜面部多種組織的前體細(xì)胞，外胚間充質(zhì)干細(xì)胞在頜面部發(fā)育和分化研究中占有重要的地位，并可為組織工程提供可靠的細(xì)胞來(lái)源，為臨床應(yīng)用奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。 目前，對(duì)外胚間充質(zhì)干細(xì)胞的前體細(xì)胞—顱神經(jīng)嵴細(xì)胞進(jìn)行了定向誘導(dǎo)分化。初步認(rèn)為，GGF、TGFβs、BMPs等生長(zhǎng)因子在體外可影響神經(jīng)嵴細(xì)胞的最終分化。其中BMP-2／4可誘導(dǎo)其分化為神經(jīng)元，GGF可誘導(dǎo)其分化為雪旺細(xì)胞，TGF-β1、2、3可誘導(dǎo)其分化為平滑肌細(xì)胞。因此，在體外用各種生長(zhǎng)因子進(jìn)行誘導(dǎo)，外胚間充質(zhì)干細(xì)胞是有可能分化為頜面部發(fā)育所需的大部分細(xì)胞的。 正常體細(xì)胞經(jīng)過(guò)有限的分裂后，會(huì)出現(xiàn)衰老、死亡。而永生化細(xì)胞具有無(wú)限增殖能力。人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)是目前最安全、可靠的永生化基因。利用hTERT永生化面突外胚間充質(zhì)干細(xì)胞，可 第四軍醫(yī)大學(xué)博土學(xué)位論文 以克服有限的細(xì)胞來(lái)源，為基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究提供充足、可靠的細(xì)胞來(lái)源。 本實(shí)驗(yàn)旨在探討人早期胚胎面突外胚間充質(zhì)干細(xì)胞的多向分化潛能，并對(duì)該 細(xì)胞永生化進(jìn)行了初步研究，主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下： 一、胚胎面突外胚間充質(zhì)干細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定 50天流產(chǎn)自愿捐贈(zèng)的胚胎，酶消化法培養(yǎng)面突外胚間充質(zhì)干細(xì)胞，白血病抑 制因子抑制分化。免疫細(xì)胞化學(xué)法染色顯示，細(xì)胞表達(dá)遷移中神經(jīng)峭細(xì)胞特異的 HNK－l；Vmentin強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，顯示其間充質(zhì)特性；Vlll因于弱表達(dá)；細(xì)胞不表達(dá) NF、GFAP、a．SMA、CK。結(jié)果表明，所獲得的細(xì)胞為未分化的外胚間充質(zhì)干細(xì) 胞，為進(jìn)一步研究其分化特性奠定了基礎(chǔ)。 二、外胚間充質(zhì)干細(xì)胞的自發(fā)分化 自發(fā)分化包括體內(nèi)及體外研究。 將培養(yǎng)的未分化外胚間充質(zhì)干細(xì)胞注入裸鼠皮下，l 周時(shí)部分細(xì)胞出現(xiàn)壞死 吸收，2周時(shí)無(wú)法找到注射的細(xì)胞，不排除細(xì)胞局部同化現(xiàn)象。 在體外，去除白血病抑制因子后2天，外胚間充質(zhì)干細(xì)胞出現(xiàn)明顯向平滑肌 細(xì)胞分化的現(xiàn)象，約的％的細(xì)胞表達(dá)平滑肌細(xì)胞特異性標(biāo)志a－SMA。二周，約有 1％的細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)纖維細(xì)絲蛋白 NF，零星細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白 GFAP，同時(shí)細(xì)胞表達(dá)1型膠原。表明外胚間充質(zhì)干細(xì)胞有分化能力，自發(fā)分化呈 現(xiàn)向平滑肌細(xì)胞優(yōu)勢(shì)分化的傾向。 三、外胚間充質(zhì)干細(xì)胞向平滑肌細(xì)胞、成骨細(xì)胞的誘導(dǎo)分化 利用生長(zhǎng)因子法誘導(dǎo)外胚間充質(zhì)干細(xì)胞在體外分化。 免疫細(xì)胞化學(xué)法圖象分析及半定量PCR顯示，TGF－日能有效促進(jìn)EMSC向 平滑肌細(xì)胞分化，平滑肌細(xì)胞比例由自發(fā)分化的65％增加到近95％。 在含p－甘油磷酸鈉、維生素乙地塞米松的礦化液中，EMSC被誘導(dǎo)分化為 成骨細(xì)胞，堿性磷酸酶活性增強(qiáng)，I型膠原染色陽(yáng)性，能形成礦化結(jié)節(jié)，細(xì)胞表達(dá) 成骨細(xì)胞特異的骨鈣素。 －4－ 第四軍醫(yī)大學(xué)博士學(xué)位論文 四、外胚間充質(zhì)干細(xì)胞向成牙本質(zhì)樣細(xì)胞的誘導(dǎo)分化 在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因于pl 和牙本質(zhì)非膠原蛋白的作用下，細(xì)胞在膠原三維培養(yǎng)體 系中呈現(xiàn)成牙本質(zhì)細(xì)胞特異的形態(tài)改變，細(xì)胞出現(xiàn)極化，胞核位于一側(cè)，另一側(cè) 有很長(zhǎng)的突起，細(xì)胞平行排列；表達(dá)牙本質(zhì)特異的涎磷蛋白（DSPP）；在礦化液中， 誘導(dǎo)細(xì)胞能形成礦化結(jié)節(jié)；在體內(nèi)，含細(xì)胞的膠原也出現(xiàn)礦化趨勢(shì)。表明EMSC 己 被成功誘導(dǎo)分化為終末期的成牙本質(zhì)樣細(xì)胞。 誘導(dǎo)分化實(shí)驗(yàn)表明，外胚間充質(zhì)干細(xì)胞具有多向分化潛能，在體外能被誘導(dǎo) 分化為多種有功能的終末分化細(xì)胞。 五、外胚間充質(zhì)干細(xì)胞的永生化 采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法，將編碼hTERT和 neo基因的真核表達(dá)載體PCIneo山TERT 導(dǎo)入外胚間充質(zhì)干細(xì)胞。＊418加壓篩選后，獲3個(gè)抗性克隆。免疫細(xì)胞化學(xué)法檢 測(cè)顯示，細(xì)胞hTERT活性得以重建，衰老現(xiàn)象得以逆轉(zhuǎn)。增殖能力變強(qiáng)�？寺�2 來(lái)源的細(xì)胞在體外長(zhǎng)期培養(yǎng)生長(zhǎng)良好，至今己 5個(gè)月、49代，越過(guò) MI期，命名 為（hTERTEMSC－2）。該細(xì)胞核型正常、在軟瓊脂內(nèi)不能生長(zhǎng)、無(wú)裸鼠致瘤性。 表明轉(zhuǎn)染的細(xì)胞是hTERT介導(dǎo)的永生化細(xì)胞，?
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2003
【分類號(hào)】：R780.2

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前3條

1 傅文玉,路艷蒙,樸英杰;人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分化與端粒酶活性[J];第一軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2001年11期

2 王林;研究與開(kāi)發(fā)人體干細(xì)胞[J];全球科技經(jīng)濟(jì)w

本文編號(hào)：2749088