【摘要】： 活髓保存治療(包括蓋髓術(shù)和切髓術(shù))主要用于牙髓可復性損傷，是保證患牙健康的基礎(chǔ)，其目的是維持牙髓-牙本質(zhì)復合體的活力與功能，要使活髓保存治療取得滿意療效，需要有良好的蓋髓材料以便將牙髓與感染組織隔離，并為牙髓組織的自身修復提供良好的生物學環(huán)境。MTA作為蓋髓劑可以有效隔絕外界刺激、保護牙髓，為牙髓修復提供適宜微環(huán)境，在誘導牙髓細胞的分化和預防感染、促進牙本質(zhì)橋形成方面發(fā)揮重要作用。人牙髓干細胞(Human Dental Plup Stem Cells，hDPSCs)是存在于牙髓組織中未分化間充質(zhì)細胞，具有多向分化潛能，可形成功能性的成牙本質(zhì)細胞和牙本質(zhì)。近年來MAPKs信號途徑在細胞增殖和分化研究領(lǐng)域備受關(guān)注，作為一種進化保守性細胞間相互作用機制，MAPKs信號途徑對多種細胞的增殖、分化和凋亡過程都有影響。 本課題在對人牙髓干細胞進行體外分離、培養(yǎng)和鑒定的基礎(chǔ)上，應用MTT、Real-time PCR和Western blot等技術(shù)，研究MTA作用于人牙髓干細胞后，對細胞存活、增殖與分化的影響，進一步研究其對MAPKs各通路總蛋白和磷酸化蛋白的影響；并應用MAPKs抑制劑和MTA聯(lián)合作用，特異性阻斷各MAPKs通路，觀察對MTA誘導人牙髓干細胞分化的影響。通過實驗明確各MAPKs通路在MTA促進人牙髓干細胞中分化標記基因表達增高中的具體調(diào)節(jié)作用，為進一步研究牙髓損傷修復過程中MTA促進人牙髓干細胞分化過程中的分子機制提供理論基礎(chǔ)。 本研究共分為三個部分： 第一部分：MTA對人牙髓干細胞增殖和分化的影響 目的體外培養(yǎng)hDPSCs，觀察MTA對體外培養(yǎng)的hDPSCs的存活、增殖和分化的影響。 材料和方法取正常19-25歲成人第三磨牙牙髓，體外分離克隆培養(yǎng)hDPSCs并鑒定；不同濃度MTA作用于hDPSCs不同時間后，通過MTT和Real-time PCR技術(shù)檢測MTA對hDPSC存活和增殖的影響，以及ALP、DSPP、BSP、OCN和COLImRNA表達的變化。 結(jié)果通過倒置顯微鏡下細胞形態(tài)學檢查，以及免疫組織化學染色證明所培養(yǎng)細胞是hDPSCs；高濃度MTA(20mg/ml和10mg/ml)明顯減低細胞的存活率，低濃度MTA (2mg/ml及以下)對細胞無毒性，促進hDPSCs的增殖，并且能引起ALP、DSPP、BSP、OCN和COLI基因的mRNA表達增高。 結(jié)論成功分離和培養(yǎng)了hDPSCs，MTA能夠促進hDPSCs的增殖和分化。 第二部分：MTA對人牙髓干細胞中MAPKs信號通路蛋白表達的影響 目的觀察MTA單獨作用及與MAPKs抑制劑聯(lián)合作用hDPSCs后，細胞中MAPKs各條通路蛋白表達的影響。 材料和方法將hDPSCs隨機分為空白對照組和MTA作用不同時間組，利用Western blot方法檢測MTA作用后，hDPSCs中ERK1/2、JNK1/2和p38總蛋白和活性蛋白(磷酸化蛋白)的表達；再將hDPSCs隨機分為空白對照組、MTA陽性對照組和MTA與MAPKs抑制劑共同作用組，Western blot檢測MTA和MAPKs通路抑制劑聯(lián)合應用后，hDPSCs中三條通路總蛋白和磷酸化蛋白的表達。 結(jié)果在MTA作用下，加抑制劑前后，與對照組比較，2h內(nèi)hDPSCs中各MAPKs通路總蛋白沒有明顯變化；而各磷酸化蛋白則發(fā)生了明顯變化。在加抑制劑前，MTA作用15min后phos-ERK、phos-JNK、phos-p38表達明顯增高；而加入抑制劑后，各通路特異性抑制劑ERK(U0126)、p38(SB203580)、JNK(SP600125)明顯降低了本通路磷酸化蛋白的表達。各組與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義。 結(jié)論MTA不能引起MAPKs通路總蛋白的變化，卻能明顯促進磷酸化蛋白的增高；MAPKs抑制劑能夠特異性抑制本通路MTA作用后磷酸化蛋白的表達。 第三部分：MAPKMAPKs通路在MTA誘導人牙髓干細胞分化過程中的作用 目的應用MAPKs阻滯劑與MTA共同作用hDPSCs后，觀察ALP、DSPP、BSP、OCN和COLI的變化，明確各條通路在hDPSCs表達分化相關(guān)基因中的作用。 材料和方法將hDPSCs隨機分為空白對照組、陽性對照組和實驗組，各通路抑制劑作用1h后，加入MTA作用12h，采用Real-time PCR法檢測ALP、DSPP、BSP、OCN和COLImRNA的變化。 結(jié)果與陽性對照組相比，加入U0126后，各基因的表達明顯下降，差異具有統(tǒng)計學意義；而加入SB203580和SP600125后，各基因的mRNA表達無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義。 結(jié)論在MTA促進hDPSCs分化標記基因表達增高中，ERK通路起主要作用，而JNK和p38通路可能沒有參與此過程。 總之，本研究發(fā)現(xiàn)MTA可促進hDPSCs的增殖和分化，并且能夠激活MAPKs通路，使hDPSCs中MAPKs磷酸化蛋白表達增高，其中ERK MAPK途徑可能參與了MTA促使hDPSCs向成牙本質(zhì)樣細胞的分化。這一研究成果，為揭示MTA促進hDPSCs向成牙本質(zhì)樣細胞分化的分子機理以及探索新的牙髓炎癥治療方法提供了實驗依據(jù)。
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R781.3
【圖文】：

2 8圖 1 E R K MA P K 信號 轉(zhuǎn) 導 途 徑 （摘 自 C el l S ig n a li n g Te c hn o l o g y we b s i t e ： H tt p : // w w w . ce l l s i g n al . c om ） S H2 結(jié)構(gòu) 域 的 底 物 發(fā) 生 活 化 。 生長 因 子 結(jié) 合 蛋 白 2 (G r b 2 ) 作為 接 頭 分 子 ，與 激活 的受 體 酪氨 酸 蛋 白激 酶 和 鳥 苷酸 釋 放 因子 ( G R Fs ) 結(jié)合 ，通 過 G R Fs 的作 用， R as 開始 釋 放G D P ，與 G T P 結(jié)合 成為 活 化態(tài) ，然 后 與 G D P -G T P 活化 因 子 S OS (s o n of s ev e n l es s ) C 端 中 富 于 脯 氨 酸 的 序 列 相 互 結(jié) 合 形 成 受 體 -G r b 2 - S OS 復 合 物 。S OS 與 R as -G D P 結(jié)合 ，使 G T P 取代 R as -G D P ，進 而R as 由 失活 態(tài)

3 0圖 2 p3 8 MA P K 信號 轉(zhuǎn) 導 途 徑 （摘 自 C el l S ig n a li n g Te c hn o l o g y we b s i t e ： H tt p : // w w w . ce l l s i g n al . c om ） IL -1 β 、 TN F - α 、 IL -6 的 產(chǎn) 生 ， 誘 導 型 一 氧 化 氮 合 酶 （ i nd u ci b l e ni t ri c ox i de s yn t ha s e， i NO S ）的 表 達 、C OX - 2 的誘 導以 及 血 管細 胞 粘附 分 子 （1 va s cu l a rc e l lad h es i on m ol ec u l e- 1 ，V C AM -1 ） 的 誘 導 等均 起 著關(guān) 鍵 性作 用 。p 3 8M AP K 的激活 主要 見 于炎 癥 反 應， 可 因 炎 癥刺 激 如 IL -1 、T N F 、 L P S 、缺 血 再灌 注 等 誘導 內(nèi) 源 性 免 疫 細 胞 如 單 核 細 胞 、 內(nèi) 皮 細 胞 和 中 性 粒 細 胞 內(nèi) p3 8 M AP K 的激 活 ， 而 p3 8 M AP K 的 激 活 對 于 上 述 細 胞 內(nèi) 炎 癥 表 型 的 表 達 是 關(guān) 鍵 性 的 。

第 四軍 醫(yī)大 學 博士 學 位論 文 已有 研 究 證實 ， 許 多細 胞 因 子、 轉(zhuǎn) 錄 因子 和 細 胞表 面 受 體的 表 達 均受 到 了 p3 8 的調(diào) 控 [ 96 ]。3. 1 . 3 JN K 信號 通路 06期 趙秀：MTA調(diào)控人牙髓干細胞分化的分子機制的研究 E074-7-2

【引證文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 丁芳;吳家媛;賈謙;劉麗;易國梅;;TGF-β1對人根尖牙乳頭干細胞增殖和分化的影響[J];牙體牙髓牙周病學雜志;2011年07期

本文編號：2747832