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富白細(xì)胞-血小板纖維蛋白對(duì)軟組織愈合及炎癥調(diào)節(jié)的研究

發(fā)布時(shí)間:2020-07-07 09:58
【摘要】:由于外傷、炎癥、長(zhǎng)期缺牙等原因,種植術(shù)區(qū)常常會(huì)遇到骨組織或軟組織缺損的問題,需要進(jìn)行各種種植外科手術(shù),如引導(dǎo)骨再生、骨劈開、上頜竇底提升等,而軟組織的良好愈合是種植外科手術(shù)成功的前提。良好的軟組織愈合能夠阻擋細(xì)菌侵入,為骨再生、種植體骨結(jié)合(osseointegration)提供良好的微環(huán)境;健康的牙齦袖口有助于獲得良好及穩(wěn)定的修復(fù)效果,因此,在種植手術(shù)后,軟組織愈合質(zhì)量的好壞,能否形成良好的生物學(xué)封閉,直接影響種植外科手術(shù)的成功與否。近年來,國內(nèi)外學(xué)者為了加快軟組織愈合速度,提高軟組織愈合質(zhì)量,做了大量的相關(guān)研究。臨床上常采用局部軟組織瓣處理、自體結(jié)締組織游離瓣移植、自體黏膜游離瓣移植等方法關(guān)閉創(chuàng)面,但是,這些方法均會(huì)提升手術(shù)難度,造成“第二術(shù)區(qū)”,增加患者痛苦,且效果有限,易發(fā)生術(shù)后并發(fā)癥。近年來,脫細(xì)胞真皮基質(zhì)開始被應(yīng)用于口腔黏膜的修復(fù),但是,其仍具有價(jià)格昂貴、倫理學(xué)爭(zhēng)議、疾病傳播風(fēng)險(xiǎn)、創(chuàng)口局部免疫反應(yīng)等問題。因此,學(xué)術(shù)界一直在尋找安全可靠、價(jià)格低廉、能夠促進(jìn)牙齦軟組織再生、避免生物安全性風(fēng)險(xiǎn)且具有抗感染能力的生物材料,這種材料無疑具有巨大的臨床價(jià)值。富白細(xì)胞-血小板纖維蛋白(Leukocyte-platelet-rich fibrin,L-PRF)是由Choukroun等人首次提取的。L-PRF作為一種富含血小板及多種生長(zhǎng)因子的自體血小板濃縮物(platelet concentrates,PCs),制備簡(jiǎn)單,不需要添加任何抗凝劑及外源性凝血酶和膠凝劑,具有高效的促進(jìn)組織再生能力,具有良好的臨床應(yīng)用潛力。因此,本研究擬探討PRF對(duì)軟組織愈合及炎癥調(diào)節(jié)的影響,為促進(jìn)口腔種植體周圍軟組織愈合提供理論依據(jù)。具體研究?jī)?nèi)容包括以下幾個(gè)方面:1.人牙齦成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)及體外炎癥模型的建立。本研究利用組織塊酶消化法培養(yǎng)人牙齦成纖維細(xì)胞,增殖迅速,細(xì)胞純化效果好,成功率高,能夠快速大量獲得原代細(xì)胞。體外炎癥模型的建立是后續(xù)研究的基礎(chǔ)。本研究通過CCK-8法篩選牙齦卟啉單胞菌-脂多糖(Porphyromonas gingivalis-lipopolysaccharide,Pg-LPS)安全濃度,確定1μg/ml為Pg-LPS的安全濃度,不影響細(xì)胞的正常生長(zhǎng)。然后利用實(shí)時(shí)qPCR確定Pg-LPS最佳刺激時(shí)間,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:1μg/ml的Pg-LPS能夠刺激成纖維細(xì)胞釋放促炎因子,并在3h和6h后,達(dá)到釋放峰值,以此作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)。2.L-PRF的結(jié)構(gòu)和生長(zhǎng)因子的釋放。本實(shí)驗(yàn)使用掃描電子顯微鏡觀察L-PRF的超微結(jié)構(gòu),通過酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)L-PRF中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)、血小板衍生因子AA(Platelet derived growth factor-AA,PDGF-AA)和類胰島素生長(zhǎng)因子-1(insulin-like growth factors-1,IGF-1)的濃度。掃描電鏡觀察L-PRF具有富含高纖維蛋白的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),在黃紅交界處滯納大量血小板和白細(xì)胞,同時(shí)至少在10天內(nèi)持續(xù)釋放組織愈合相關(guān)的生長(zhǎng)因子(TGF-β1、PDGF-AA和IGF-1),具有一定的長(zhǎng)效性,因此,我們認(rèn)為,L-PRF在調(diào)節(jié)組織愈合方面具有很大的潛力。3.L-PRF對(duì)人成纖維細(xì)胞增殖的影響及對(duì)炎癥的調(diào)節(jié)。本實(shí)驗(yàn)通過CCK-8(cell counting kit-8)檢測(cè)了L-PRF對(duì)人牙齦成纖維細(xì)胞增殖能力的影響。通過顯微鏡觀察L-PRF對(duì)衰老細(xì)胞增殖的影響,通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)L-PRF對(duì)Pg-LPS刺激的成纖維細(xì)胞炎癥因子釋放的影響。CCK-8結(jié)果顯示,100%、50%和25%的L-PRF條件培養(yǎng)基均可促進(jìn)人牙齦成纖維細(xì)胞增殖,并且呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。其中100%的L-PRF條件培養(yǎng)基促進(jìn)增殖效果最明顯。因而,選擇100%的L-PRF條件培養(yǎng)液作為最佳濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。顯微鏡觀察L-PRF條件培養(yǎng)基培養(yǎng)衰老細(xì)胞結(jié)果顯示,L-PRF能夠恢復(fù)衰老的HGFCs細(xì)胞的生物學(xué)特性,促進(jìn)衰老細(xì)胞增殖。ELISA結(jié)果顯示用1□g/ml的Pg-LPS刺激人牙齦成纖維細(xì)胞6小時(shí)后,人牙齦成纖維細(xì)胞分泌的IL-1□,TNF-□,和IL-6顯著升高,而令人驚訝的是,經(jīng)L-PRF處理后,Pg-LPS誘導(dǎo)的人牙齦成纖維細(xì)胞分泌IL-1□,TNF-□,和IL-6受到了顯著抑制。4.L-PRF參與炎癥調(diào)節(jié)的體外研究。本實(shí)驗(yàn)建立了兔體內(nèi)組織炎癥模型,觀察動(dòng)物體重變化,創(chuàng)口愈合面積和組織蘇木精和伊紅染色評(píng)價(jià)L-PRF對(duì)口腔組織炎癥的調(diào)節(jié)作用。本研究使用50%醋酸對(duì)口腔牙齦進(jìn)行直接刺激,并在第4天引起了口腔炎癥。醋酸處理后第4天口腔粘膜炎面積達(dá)到最大值?谇粷冃纬珊,第7天對(duì)照組的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體重減輕,但于第14天又恢復(fù)。與之對(duì)比,L-PRF處理組的體重隨時(shí)間增加,實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組在第7天和第14天體重差異顯著。在第7天L-PRF治療組的潰瘍面積明顯小于對(duì)照組,這意味著該組的愈合速度更快。第14天,L-PRF治療組的粘膜潰瘍明顯縮小,且成為面積最小的組。HE染色鏡下組織病理學(xué)檢查,刺激前正常對(duì)照的標(biāo)本上皮完整,無炎性細(xì)胞浸潤。刺激后,在第7天,上皮層破壞明顯,隨后上皮層厚度發(fā)生改變,對(duì)照組的炎癥細(xì)胞浸潤更為嚴(yán)重。第7天,L-PRF治療組開始了不完全的上皮再生,且愈合過程比對(duì)照組更快,表現(xiàn)為潰瘍更小,炎癥細(xì)胞浸潤更少。第14天,治療組基本恢復(fù),再上皮化接近完成,創(chuàng)面愈合速度明顯快于對(duì)照組。第21天,兩組均完成再上皮化,L-PRF組的愈合明顯完全。5.L-PRF對(duì)種植體周圍組織愈合及術(shù)后炎癥控制的影響:隨機(jī)對(duì)照臨床研究。本研究建立了一項(xiàng)前瞻性隨機(jī)對(duì)照臨床研究,以評(píng)估白細(xì)胞-血小板富纖維蛋白(L-PRF)對(duì)種植體周圍組織反應(yīng)的影響。本臨床研究于2016年2月至2017年11月在吉林大學(xué)附屬口腔醫(yī)院進(jìn)行,隨機(jī)選取20例患者(男15例,女5例),平均年齡38歲(30-44歲),種植20顆植體。每組均有10個(gè)種植位點(diǎn),其中I組為PRF組(試驗(yàn)組),II組為無PFR組(對(duì)照組)。通過術(shù)后疼痛評(píng)估,黏膜腫脹評(píng)估,創(chuàng)口愈合面積評(píng)估,術(shù)后種植體近遠(yuǎn)中骨高度和牙周袋深度變化測(cè)定,術(shù)后患者滿意度調(diào)查幾方面評(píng)價(jià)L-PRF對(duì)種植體周圍組織愈合及術(shù)后炎癥控制的影響。研究結(jié)果表明L-PRF能夠顯著減少術(shù)后疼痛和黏膜腫脹,加快創(chuàng)口愈合速度,骨水平增量和牙周健康都得到了保障,患者對(duì)整個(gè)種植修復(fù)過程感到滿意。因此,這些病例顯示了L-PRF促進(jìn)種植體周圍組織愈合的成功應(yīng)用,為進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供了新的思路。綜上所述,L-PRF對(duì)種植體周圍組織愈合及炎癥調(diào)節(jié)具有積極調(diào)節(jié)作用。
【學(xué)位授予單位】:吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】:博士
【學(xué)位授予年份】:2019
【分類號(hào)】:R783.6
【圖文】:

組織修復(fù),血小板,纖維蛋白


圖 1.1 組織修復(fù)涉及的階段的順序說明1.1 富血小板纖維蛋白促進(jìn)軟組織愈合的研究進(jìn)展1.1.1 概述目前,在開發(fā)能夠調(diào)節(jié)炎癥因子、提高組織愈合速度的生物添加劑方面,臨床研究仍面臨著重重困難。雖然早在 30 多年前就對(duì)纖維蛋白類物質(zhì)的應(yīng)用進(jìn)行了解釋[6],但由于制備工藝復(fù)雜,且存在交叉感染的風(fēng)險(xiǎn),其使用仍存在爭(zhēng)議。隨著血小板濃縮技術(shù)的發(fā)展以及制作方法的改進(jìn),富血小板血漿(platelet-rich plasma,PRP)在 20 世紀(jì) 70 年代初首次被開發(fā)出來,并在 20 世紀(jì)80 年代開始流行[7-9]。第一代 PRP 是通過將收集到的血液與凝血酶和過量的鈣混合,導(dǎo)致活化的血小板被固定在纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)中。PRP 的制備是通過二次離心得

纖維蛋白,生物活性分子,細(xì)胞類型,富集


PRP 可進(jìn)一步促進(jìn)軟組織或硬組織的外科傷口愈合。Whitman 等人開發(fā)了商業(yè)化的 PRP[16],他們是第一批嘗試在口腔外科手術(shù)中應(yīng)用 PRP 的研究者。在研究中他們發(fā)現(xiàn),不論是在宿主骨還是在移植骨材料中,成骨細(xì)胞都有被激活的現(xiàn)象。然而,這個(gè)過程存在多種風(fēng)險(xiǎn),使用牛凝血酶制備的 PRP,產(chǎn)生的相關(guān)抗體可能對(duì)患者造成潛在的生命危險(xiǎn),同時(shí),抗凝因子的使用可能延遲傷口的正常愈合,這些問題使其應(yīng)用受到限制。2000 年,法國科學(xué)家提出了新一代血小板濃縮物的概念,并將這種新產(chǎn)品命名為 L-PRF[5]。L-PRF 內(nèi)富含大量的血小板,血小板內(nèi)含有許多重要的生長(zhǎng)因子,可促進(jìn)細(xì)胞增殖、膠原生成、白細(xì)胞趨化、血管生成和細(xì)胞分化。同時(shí),L-PRF 還富含大量的白細(xì)胞,這些白細(xì)胞在創(chuàng)口愈合過程起到重要作用[13, 18-22]。此外,L-PRF 含有增強(qiáng)骨改建的三種粘附分子(纖維蛋白、纖連蛋白和維甲酸)?鼓齽┑募尤胝T導(dǎo)了 PRP 的聚合,但 L-PRF 的聚合是一個(gè)自然而緩慢的過程。因此,L-PRF 具有更適合細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子儲(chǔ)存以及細(xì)胞遷移的纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[23, 24],如圖 1.2。

成纖維細(xì)胞,傷口愈合,口腔,趨化因子


它們需要被“激活”,這意味著它們必須能夠感知和響應(yīng)外部刺激。直到最近 20 年,我們才意識(shí)到,成纖維細(xì)胞它還具有就監(jiān)測(cè)結(jié)締組織內(nèi)環(huán)境平衡的重要作用,是機(jī)體內(nèi)的 “前哨” 。 成纖維細(xì)胞存在于許多組織中,是第一個(gè)對(duì)組織損傷或細(xì)菌感染起反應(yīng)的細(xì)胞(圖 1)。在急性創(chuàng)傷中,血液會(huì)滲漏進(jìn)入組織間質(zhì),聚集的血小板釋放生長(zhǎng)因子和趨化因子,不僅會(huì)吸引免疫細(xì)胞,也會(huì)直接刺激此處的成纖維細(xì)胞產(chǎn)生和分泌更多的趨化因子,尤其 IL-6 和 IL-8,并在損傷部位召集中性粒細(xì)胞[67]。當(dāng)感染時(shí),脂多糖和其他細(xì)菌產(chǎn)物會(huì)再次誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞產(chǎn)生 IL-6、IL-8 和其他趨化因子。一個(gè)在成纖維細(xì)胞和聚集的免疫細(xì)胞之間形成的復(fù)雜級(jí)聯(lián)反應(yīng),主導(dǎo)了后續(xù)的炎癥和組織修復(fù)。成纖維細(xì)胞表面上的CD40(TNF-α 受體家族的成員) ,和外來的免疫細(xì)胞表面的 CD40-L 之間形成了細(xì)胞的直接接觸[68]。這些接觸導(dǎo)致這兩種類型細(xì)胞的相互激活:結(jié)果,成纖維細(xì)胞分泌更多的趨化因子,免疫細(xì)胞進(jìn)一步釋放炎癥細(xì)胞因子,導(dǎo)致對(duì)損傷反應(yīng)的放大 (圖 1.3) 。

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9 韋海濤;牙齦成纖維細(xì)胞在機(jī)械壓應(yīng)力刺激下細(xì)胞骨架及細(xì)胞凋亡的體外研究[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2014年

10 陳嵩;人牙齦成纖維細(xì)胞體外誘導(dǎo)成骨分化的實(shí)驗(yàn)研究[D];南京大學(xué);2013年



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