【摘要】：目的:慢性根尖周炎(chronic apical periodontitis,CAP)是指根管內(nèi)長(zhǎng)期存在感染及病原刺激物而導(dǎo)致的根尖周圍組織慢性炎癥反應(yīng),表現(xiàn)為炎癥性肉芽組織的形成和牙槽骨的破壞。牙髓卟啉單胞菌(Porphyromonas endodontalis,P.endodontalis)是牙髓感染的特有病原菌,其脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)是重要的毒力因子,可刺激細(xì)胞分泌大量致炎因子,如:白細(xì)胞介素-1(interleukin-1,IL-1)、IL-6、IL-8和腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF)等,在局部發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。P.endodontalis LPS誘導(dǎo)成骨細(xì)胞產(chǎn)生的IL-6可以刺激成骨細(xì)胞產(chǎn)生其它炎癥因子,促進(jìn)破骨前體細(xì)胞分化,抑制成骨細(xì)胞活性,還可以直接與破骨細(xì)胞表面受體結(jié)合,引發(fā)破骨細(xì)胞反應(yīng)。有研究表明,在LPS所誘導(dǎo)的細(xì)胞炎性反應(yīng)中,miR-146a-5p通過(guò)抑制其靶基因腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子-6(TNF receptor-associated factor-6,TRAF6)、白介素受體相關(guān)激酶-1(Interleukin receptor-associated kinase-1,IRAK1)的表達(dá),減少下游炎癥因子的釋放,起到抑制炎癥的作用,但miR-146a-5p是否參與到CAP的調(diào)控,是否在P.endodontalis LPS誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞炎癥中同樣發(fā)揮抑炎的作用,尚未見報(bào)道。Hey(hairy and Enhancer-of-split related with YRPW motif,Hey)基因是轉(zhuǎn)錄因子超家族bHLH(堿性-螺旋-環(huán)-螺旋,basic-helix-loop-helix,bHLH)的一員,Hey2作為Notch信號(hào)通路的直接下游靶基因,參與心臟發(fā)育、血管生成、骨組織分化、牙齒發(fā)育及損傷后牙髓的再生與修復(fù)等生物學(xué)行為。前期利用生物信息學(xué)手段預(yù)測(cè)Hey2可能是miR-146a-5p一個(gè)潛在的靶基因,兩者是否真的具有靶向作用,Hey2是否參與慢性根尖周炎的調(diào)控,在P.endodontalis LPS誘導(dǎo)成骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)中發(fā)揮何種作用尚未見報(bào)道。綜上所述,本研究以小鼠成骨細(xì)胞模型為主要研究對(duì)象,通過(guò)檢測(cè)miR-146a-5p、Hey2在慢性根尖周炎中的表達(dá),探討在P.endodontalis LPS誘導(dǎo)成骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)中miR-146a-5p、Hey2、IL-6三者的相互作用,以揭示在慢性根尖周炎中miR-146a-5p、Hey2的作用機(jī)制及意義,完善Hey2作為轉(zhuǎn)錄抑制因子在炎癥反應(yīng)中的調(diào)控機(jī)制,以期為慢性根尖周炎的治療提供新的靶點(diǎn)。材料與方法:一、實(shí)驗(yàn)方法1、培養(yǎng)P.endodontalis,完成LPS的提取和鑒定。2、培養(yǎng)小鼠成骨細(xì)胞MC3T3-E1、SV40T轉(zhuǎn)化的人胚腎細(xì)胞293T。3、取得倫理委員會(huì)批準(zhǔn)及患者知情同意后,病例組共收集到20例根尖周病損組織樣本,對(duì)照組共收集到13例健康牙的牙周膜組織樣本。4、采用蘇木素-伊紅(Hematoxylin-Eosin,H-E)染色檢測(cè)慢性根尖周炎組織的炎癥浸潤(rùn)程度。5、采用免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry,IHC)染色檢測(cè)慢性根尖周炎組織中Hey2蛋白的表達(dá)。6、將miR-146a-5p化學(xué)合成模擬物、抑制劑、Hey2過(guò)表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至MC3T3-E1細(xì)胞。7、采用實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(real-time reverse transcription-polymerase chain reaction,real-time RT-PCR)方法檢測(cè)各組miR-146a-5p、Hey2、IL-6 mRNA的相對(duì)表達(dá)情況。8、采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(enzyme-like immunosorbent assay,ELISA)檢測(cè)各組IL-6蛋白分泌情況。9、采用蛋白印跡(Western blot)方法檢測(cè)各組Hey2蛋白水平的變化。10、在293T細(xì)胞中,通過(guò)雙熒光素酶活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-146a-5p與Hey23‘UTR結(jié)合情況。11、采用染色質(zhì)免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation,ChIP)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)10μg/ml的P.endodontalis LPS作用MC3T3-E1細(xì)胞24 h后,Hey2蛋白與IL-6啟動(dòng)子的結(jié)合情況。二、統(tǒng)計(jì)方法每組實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次,除患者性別比較采用Mann-Whitney U秩和檢驗(yàn)外,其它所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,用SPSS 18.0軟件建立數(shù)據(jù)庫(kù),采用單因素方差分析和Dunnett t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,以雙側(cè)P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:一、慢性根尖周炎組織中miR-146a-5p、Hey2的表達(dá)1、病損組織中存在大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。2、Hey2定位在胞核及胞質(zhì)中,在漿細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞中呈陽(yáng)性表達(dá)。3、miR-146a-5p、Hey2在慢性根尖周炎病損組織中的相對(duì)表達(dá)量明顯高于對(duì)照組健康牙周膜組織。二、miR-146a-5p與P.endodontalis LPS誘導(dǎo)MC3T3-E1細(xì)胞表達(dá)IL-6呈負(fù)相關(guān)性1、不同質(zhì)量濃度的P.endodontalis LPS作用于MC3T3-E1細(xì)胞24 h,miR-146a-5p相對(duì)表達(dá)量顯著升高,具有劑量依賴性;IL-6的表達(dá)也顯著升高,最大值出現(xiàn)在10μg/mL組。2、10μg/mL質(zhì)量濃度的P.endodontalis LPS作用于MC3T3-E1細(xì)胞不同時(shí)間,可誘導(dǎo)miR-146a-5p、IL-6表達(dá)升高,最大值出現(xiàn)在10 h組。3、在P.endodontalis LPS誘導(dǎo)MC3T3-E1細(xì)胞產(chǎn)生炎癥反應(yīng)過(guò)程中,過(guò)表達(dá)miR-146a-5p,IL-6的表達(dá)受到抑制;抑制miR-146a-5p后,IL-6的表達(dá)升高。三、miR-146a-5p靶向調(diào)控Hey2的機(jī)制研究1、P.endodontalis LPS誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞炎癥反應(yīng)中,miR-146a-5p負(fù)向調(diào)控Hey2的表達(dá);過(guò)表達(dá)Hey2后,miR-146a-5p的表達(dá)下降。2、雙熒光素酶活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-146a-5p可以與Hey2 3’UTR區(qū)特定的位點(diǎn)結(jié)合,過(guò)表達(dá)miR-146a-5p后,可抑制Hey2 3’UTR WT組相對(duì)熒光素酶活性。四、Hey2抑制P.endodontalis LPS誘導(dǎo)MC3T3-E1細(xì)胞表達(dá)IL-61、5、10、15μg/mL質(zhì)量濃度的P.endodontalis LPS可誘導(dǎo)MC3T3-E1細(xì)胞表達(dá)Hey2;當(dāng)10μg/mL P.endodontalis LPS作用時(shí)間達(dá)到24、48 h,Hey2的表達(dá)顯著升高。2、在P.endodontalis LPS作用下過(guò)表達(dá)Hey2,可以抑制IL-6的表達(dá)。3、10μg/ml P.endodontalis LPS刺激MC3T3-E1細(xì)胞24 h,促使Hey2綁定于IL-6啟動(dòng)子-400~-200 bp區(qū)域。結(jié)論:1、在慢性根尖周炎病損組織內(nèi)可檢測(cè)到miR-146a-5p、Hey2的表達(dá),且表達(dá)量顯著高于正常牙周膜組織,推測(cè)miR-146a-5p、Hey2可能參與慢性根尖周炎的發(fā)病過(guò)程。2、P.endodontalis LPS誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)中,miR-146a-5p與炎癥因子IL-6的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性,推測(cè)miR-146a-5p起到抑制炎癥的作用。3、miR-146a-5p與Hey2可以形成互補(bǔ)的負(fù)反饋環(huán),miR-146a-5p與Hey2 3’UTR區(qū)特定的位點(diǎn)結(jié)合,證實(shí)Hey2是miR-146a-5p的靶基因之一。4、P.endodontalis LPS可以誘導(dǎo)MC3T3-E1細(xì)胞表達(dá)Hey2,Hey2通過(guò)與IL-6啟動(dòng)子區(qū)域綁定,抑制IL-6的表達(dá),推測(cè)在成骨細(xì)胞炎癥反應(yīng)中Hey2可作為IL-6的轉(zhuǎn)錄抑制因子發(fā)揮作用。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R781.341
【圖文】：

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1 慢性根尖周炎組織中miR-146a-5p、Hey2 的表達(dá)3.1.1 H-E 染色檢測(cè)慢性根尖周炎組織中炎癥浸潤(rùn)程度H-E 染色結(jié)果可見，在正常牙周膜組織中，未見明顯的炎癥組織浸潤(rùn)（圖 1A）；在根尖周炎病損組織中，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，主要包括：淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、漿細(xì)胞及巨噬細(xì)胞等，還可見新生的毛細(xì)血管及紅細(xì)胞（圖 1B）。

圖 2 免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)慢性根尖周炎組織中 Hey2 蛋白的表達(dá)。A：對(duì)照組空白對(duì)照(×200)；B：病例組空白對(duì)照(×200)；C：Hey2 在健康牙周膜組量陽(yáng)性表達(dá)(×200)；D：Hey2 在根尖周病損組織中的陽(yáng)性表達(dá)(×200)；E：對(duì)照組細(xì)胞上有 Hey2 的少量表達(dá)(×400)；F.：病例組漿細(xì)胞、中性粒細(xì)胞及巨噬細(xì)胞中達(dá)如箭頭所示(×400)。3 Real-Time RT-PCR 檢測(cè)慢性根尖周炎組織中 miR-146a-5p、Hey2 mRNA達(dá)量共有20例患者符合標(biāo)準(zhǔn)納入病例組，其中女12人，男8人，平均年齡48.5 有 13 例健康志愿者符合標(biāo)準(zhǔn)納入對(duì)照組，其中女 8 人，男 5 人，平均年齡.8 歲。兩組年齡經(jīng) Dunnett t 檢驗(yàn)無(wú)顯著性差異（P>0.05），性別的差n-Whitney U 秩和檢驗(yàn)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），兩組的數(shù)據(jù)具有可比l-Time RT-PCR 結(jié)果顯示，病例組與對(duì)照組均有 miR-146a-5p、Hey2 mRNA

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2739322