【摘要】： 隨著人口老齡化問題日益嚴重，口腔修復患者中原發(fā)性骨質(zhì)疏松癥的老年患者越來越多。由于骨質(zhì)疏松導致骨量不足、骨密度過低，不能進行正常的種植修復，或者常規(guī)修復效果不理想。如何治療和控制骨質(zhì)疏松的發(fā)病，解決因此帶來的骨量不足，重建骨組織的健康結(jié)構(gòu)和功能，是口腔醫(yī)學，骨整形、以及骨缺損重建等臨床醫(yī)學所關(guān)心的問題。 甲狀旁腺激素(PTH)是一種重要的體內(nèi)維持鈣穩(wěn)態(tài)及骨代謝的全身性調(diào)節(jié)激素，其靶細胞為成骨細胞和腎小管細胞。2002年12月，F(xiàn)orteo商品名叫特立派汰的人工合成PTH被FDA認證，作為治療骨質(zhì)疏松藥物。研究證明，PTH對依據(jù)給藥方式不同對骨組織產(chǎn)生雙重作用。小劑量、間斷式甲狀旁腺激素(PTH)皮下注射能有效地促進骨骼合成；持續(xù)作用刺激骨轉(zhuǎn)化，增加破骨細胞的活性和降低皮質(zhì)骨量，導致松質(zhì)骨喪失。PTH主要通過骨形成的三個階段發(fā)揮作用的：1，刺激前期成骨細胞增殖；2，促進前期成骨細胞，但是抑制成熟的成骨細胞的分化；3，抑制成骨細胞凋亡。其中是否前期成骨細胞增殖提高還不是很清楚。PTH對骨組織的另一重作用是持續(xù)性大劑量注射PTH，則抑制成骨細胞增殖分化，活化破骨細胞。 通過PTH以及應(yīng)力對成骨細胞作用機制的研究發(fā)現(xiàn)，二者對成骨細胞的影響有很多共同的作用機理，這預(yù)示PTH和機械應(yīng)力之間可能有著某種協(xié)同關(guān)系。有關(guān)PTH對成骨樣細胞的機械應(yīng)力響應(yīng)的調(diào)節(jié)作用的基礎(chǔ)研究，目前還未見國內(nèi)報道。因此，有必要對PTH調(diào)控成骨樣細胞的機械響應(yīng)機制作進一步的研究，并尋求發(fā)現(xiàn)PTH和機械應(yīng)力間的內(nèi)在聯(lián)系。 目的： 本課題旨在通過對體外培養(yǎng)的人成骨樣細胞MG63，加載不同強度的牽張刺激，通過測定不同刺激強度對該細胞的線粒體跨膜電位(Δψ，m)、ALPase、細胞增殖及細胞內(nèi)鈣離子濃度的變化，初步篩選出一個牽張閾值；進而采用低濃度的甲狀旁腺激素(20ng／ml)，采用間斷和持續(xù)作用于閾上刺激后的人成骨樣細胞MG63，通過觀察其礦化結(jié)節(jié)的形成情況，以及采用RT-PCR技術(shù)檢測人甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白(PHT／PTHrP)和骨鈣素(OCN)的mRNA表達情況，初步探討甲狀旁腺激素對不同機械力作用下的成骨樣細胞的生物學效應(yīng)。以期探討通過全身或局部藥物作用，來影響機械載荷下的牙槽骨改建，預(yù)防或減緩其吸收。為口腔修復、種植和正畸臨床醫(yī)學提供基礎(chǔ)性的研究。 方法： 1．采用低滲透液式加力方式，對體外培養(yǎng)的細胞進行牽張刺激。采用不同濃度的甘露醇調(diào)節(jié)低滲透壓的大小，模擬體外細胞受力的強度。 2．采用人成骨樣細胞MG63的細胞株進行體外培養(yǎng)，觀察細胞形態(tài)，繪制細胞生長曲線為低滲透壓加載實驗準備實驗細胞。 3．采用低滲透壓對體外培養(yǎng)的MG63進行加載，通過激光掃描共聚焦顯微鏡觀測細胞線粒體形態(tài)，圖像分析軟件分析線粒體跨膜電位的變化；通過分析ALP以及細胞內(nèi)鈣離子濃度的變化分析低滲透壓對MG63的影響，初步篩選出一個低滲透壓閾值，為后期PTH實驗研究準備實驗條件。 4．采用化學熒光檢測技術(shù)，對加入細胞培養(yǎng)基中不同時間的PTH的免疫活性進行藥物動力學檢測，分析PTH的代謝特性，并繪制代謝曲線。排除由于PTH代謝導致藥效濃度過低，可能產(chǎn)生的實驗結(jié)果的偏差。 5．對閾上刺激后的MG63進行低濃度的PTH間斷和連續(xù)刺激，采用RT-PCR技術(shù)檢測細胞內(nèi)甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白PHT／PTHrP和骨鈣素OCN的mRNA表達情況。 6．采用茜素紅染色技術(shù)，觀察PTH作用前后的MG63礦化誘導情況，并采用分光光度儀定量檢測鈣化結(jié)節(jié)的情況。 結(jié)果： 1．通過對線粒體膜電位的檢測發(fā)現(xiàn)，隨著滲透壓的降低，以及作用的時間延長，膜電位有增高的趨勢，其中277mOsm膜電位輕度增高，但與對照組沒有明顯差別(P＞0.05)；240mOsm組的膜電位總體高于對照組(P＜0.05)，且作用2h、4h和6h時，膜電位明顯高于對照組，在作用4h時達到峰值。163mOsm在作用初期，就有明顯的膜電位增高，但是隨著作用時間的延長，膜電位降低，且作用4h以后，已經(jīng)明顯低于對照組(P＜0.05)。 2．通過MTT生長曲線分析發(fā)現(xiàn)所有細胞均近似“s”形，有明顯的滯留期、指數(shù)生長期、平臺期。隨著滲透壓的降低，細胞滯留期變短，對數(shù)生長期提前，較早進入平臺期。 3．通過對低滲壓作用后的MG63的ALP，以及胞內(nèi)鈣離子濃度〔Ca~(2+)〕_i變化分析發(fā)現(xiàn)，低滲處理組中，277mOsm、240mOsm和163mOsm組早期ALP活性降低，以后隨著作用時間延長，有所增加，但是仍然低于對照組。三個低滲處理組中各時間組的〔Ca~(2+)〕_i均高于對照組(P＜0.05)，且隨著作用時間延長也是呈現(xiàn)增高趨勢，分別在24h、12h和8h達到峰值，以后逐漸回落，但是仍然明顯高于對照組。 4．通過對PTH藥物動力學研究發(fā)現(xiàn)，在實驗設(shè)計的觀測期內(nèi)(24h)，PTH的免疫活性沒有明顯降低。說明實驗設(shè)計的觀測期合理，排除了實驗結(jié)果是由于激素代謝導致藥效降低引起的誤差。 5．PTH對成骨樣細胞MG63的礦化影響具有時間依賴性，與藥物濃度關(guān)系不大。 6．間斷使用PTH和牽張力具有刺激成骨樣細胞MG63增殖分化的作用；小劑量、間斷PTH刺激應(yīng)力狀態(tài)下的成骨樣細胞6h，PTHrPmRNA高表達，OCmRNA表達受到抑制。刺激3h則PTHrPmRNA的表達降低，而OCmRNA表達輕度升高；作用1h則PTHrPmRNA和OCmRNA的表達與對照組沒有明顯差異；相反PTH連續(xù)作用24h時，PTHrPmRNA和OCmRNA的表達均明顯降低。 7．間斷低濃度使用hPTH1-34，有助于應(yīng)力載荷后的成骨增殖活力的恢復，緩解過載荷狀態(tài)下成骨細胞的增殖抑制，利于基質(zhì)骨礦化的形成；且加強地塞米松的成骨誘導作用 結(jié)論： 1．低滲透液作為一種應(yīng)用于研究細胞離子通道的加力方式，同樣可以適用于研究細胞體外受力的生物學特性。其隨著滲透壓的逐漸降低，對成骨樣細胞所產(chǎn)生的作用效果，與以往采用四點彎曲等加載方式有著一定的相似作用趨勢。 2．采用低滲透液進行細胞體外受力研究發(fā)現(xiàn)，在一定條件下(270～240mOsm，作用4—6小時)，對成骨樣細胞MG63具有促進增殖分化的作用，過強(163mOsm，作用4—6小時)、過小(270mOsm，作用0.5—2小時)的應(yīng)力都不利于該細胞成熟分化。 3．對閾上刺激后的MG63，采用小劑量(20ng／ml) hPTH1-34的間斷誘導，具有調(diào)節(jié)PTHrPmRNA和OCmRNA的表達的作用。其中對閾上刺激后4h，PTH間斷作用6h，細胞的PTHrPmRNA的表達明顯增高，OCmRNA的表達則受到一定的抑制作用。結(jié)合胞內(nèi)游離鈣濃度的變化，說明兩種基因表達的變化可能與胞內(nèi)鈣離子通道有關(guān)。同時，該實驗條件下的細胞礦化誘導后基質(zhì)的礦化結(jié)節(jié)形成增多。也提示hPTH1-34對閾上刺激后的MG63的影響與鈣離子通道之間有一定的關(guān)系。 4．現(xiàn)有細胞學實驗，為動物應(yīng)力損傷實驗奠定了基礎(chǔ)，將有助于更深層次的了解PTH對骨組織機械學響應(yīng)的影響作用。
【學位授予單位】：四川大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2007
【分類號】：R783;R580

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 王政通;王莉;;終末期腎臟病患者血管鈣化危險因素及其調(diào)節(jié)因子[J];實用醫(yī)院臨床雜志;2011年05期

2 趙亞紅;柯櫻;王敏偉;;納米銅粉對去卵巢大鼠骨量丟失的預(yù)防作用及其機制探討[J];世界臨床藥物;2011年07期

3 齊永芬;唐朝樞;;血管鈣化—血管損傷性疾病的共同病理生理基礎(chǔ)[J];中南醫(yī)學科學雜志;2011年03期

4 ;[J];;年期

5 ;[J];;年期

6 ;[J];;年期

7 ;[J];;年期

8 ;[J];;年期

9 ;[J];;年期

10 ;[J];;年期

相關(guān)會議論文 前10條

1 李京寶;羅明志;王亮;騫愛榮;商澎;;模擬失重對成骨樣細胞纖連蛋白裝配的影響[A];2011年空間生命與生命起源暨航天醫(yī)學工程學術(shù)研討會論文集[C];2011年

2 龍潔;田衛(wèi)東;鄭曉輝;樊瑜波;李聲偉;;張力作用下成骨樣細胞PGE_2的表達[A];中國生物醫(yī)學工程學會第六次會員代表大會暨學術(shù)會議論文摘要匯編[C];2004年

3 劉穎;周征;鄭翼;趙志河;;機械壓力對體外培養(yǎng)的成骨樣細胞內(nèi)Ca~(2+)濃度影響的研究[A];第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)院2004第七屆全國口腔正畸學術(shù)會議論文匯編[C];2004年

4 龍潔;田衛(wèi)東;鄭曉輝;樊瑜波;李聲偉;;張力作用下成骨樣細胞PGE_2的表達[A];中國康復醫(yī)學會修復重建外科專業(yè)委員會第十四次全國學術(shù)交流會論文集[C];2004年

5 陳筱雨;李愛;胡新武;張亮品;劉長金;劉烈矩;;低滲透壓對大鼠三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元ATP-激活電流的抑制作用[A];湖北省生理學會2007年度年會暨學術(shù)報告會論文集[C];2007年

6 龍潔;田衛(wèi)東;鄭曉輝;樊瑜波;李聲偉;;張力作用下成骨樣細胞PGE_2的表達[A];中國康復醫(yī)學會修復重建外科專業(yè)委員會第十四次全國學術(shù)交流會論文集[C];2004年

7 田衛(wèi)東;龍潔;鄭曉輝;樊瑜波;李聲偉;;不同頻率的張力對成骨樣細胞NF-κBp65表達活性的影響[A];中國康復醫(yī)學會修復重建外科專業(yè)委員會第十四次全國學術(shù)交流會論文集[C];2004年

8 田衛(wèi)東;龍潔;鄭曉輝;樊瑜波;李聲偉;;不同頻率的張力對成骨樣細胞NF-κBp65表達活性的影響[A];中國生物醫(yī)學工程學會第六次會員代表大會暨學術(shù)會議論文摘要匯編[C];2004年

9 鄭翼;周征;劉穎;羅頌椒;;機械壓力對成骨樣細胞前列腺素E2及環(huán)磷酸腺苷影響的體外實驗研究[A];第四軍醫(yī)大學口腔醫(yī)院2004第七屆全國口腔正畸學術(shù)會議論文匯編[C];2004年

10 劉武;夏雄智;樊粵光;劉建仁;王海彬;曾毅榮;;人成骨樣細胞OS-732酒精干預(yù)和六味地黃丸含藥血清治療作用的實驗研究[A];2009第十七屆全國中西醫(yī)結(jié)合骨傷科學術(shù)研討會論文匯編[C];2009年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 軒滔;秋季養(yǎng)蟹三注意[N];經(jīng)濟日報.農(nóng)村版;2006年

2 馮國民;秋季慎防河蟹死亡[N];河北農(nóng)民報;2007年

3 楓樺;河蟹入秋防死亡[N];中國漁業(yè)報;2006年

4 廣西中醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院腎內(nèi)科 萬強邋史偉 肖敬;對馬兜鈴酸腎病的認識與治療[N];中國中醫(yī)藥報;2007年

5 楓樺;河蟹入秋防死亡[N];中國漁業(yè)報;2008年

6 肖祥云;下肢浮腫成因六探[N];中國婦女報;2006年

7 馮麗 梓樺;中草藥腎毒性問題不容回避[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2003年

8 北京體育科研所研究員 周琴璐;高血壓患者運動三注意[N];健康報;2007年

9 唐夏;專家詳解夏季飲料選擇[N];中國消費者報;2007年

10 惠恩舉;防河蟹秋季死亡[N];中國特產(chǎn)報;2000年

相關(guān)博士學位論文 前10條

1 張衛(wèi)群;甲狀旁腺激素與低滲透壓聯(lián)合調(diào)控成骨樣細胞MG63生物學效應(yīng)的研究[D];四川大學;2007年

2 史瑞新;弱激光照射對受張力的成骨樣細胞的早期影響及信號轉(zhuǎn)導機制的研究[D];吉林大學;2011年

3 李師君;MicroRNA-133a調(diào)控血管平滑肌細胞向成骨樣細胞分化的功能研究[D];中南大學;2012年

4 熊志立;青娥方促進成骨細胞骨形成活性成分的相關(guān)研究[D];沈陽藥科大學;2003年

5 王冰;模擬失重環(huán)境對大鼠骨肉瘤成骨樣細胞MAPK信號轉(zhuǎn)導功能的影響[D];中國人民解放軍第四軍醫(yī)大學;2003年

6 孟繁浩;中藥精選小復方骨疏丹促成骨細胞骨形成作用的研究[D];沈陽藥科大學;2004年

7 黃曉兵;骨髓間充質(zhì)干細胞誘導分化成骨細胞支持臍血造血干/祖細胞培養(yǎng)研究[D];四川大學;2006年

8 夏雄智;補腎法對激素干預(yù)成骨樣細胞作用的差異蛋白初步分析及相關(guān)研究[D];廣州中醫(yī)藥大學;2007年

9 崔蓉蓉;microRNA和apelin調(diào)控血管平滑肌細胞向成骨樣細胞分化和凋亡[D];中南大學;2012年

10 潘明;高原鼢鼠藥用價值及分子機制研究[D];四川大學;2005年

相關(guān)碩士學位論文 前10條

1 李少妮;機械牽張力對成骨樣細胞影響的糖蛋白組學的初步研究[D];第四軍醫(yī)大學;2012年

2 胡安全;福莫特羅和ICI118551對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞來源的成骨樣細胞增殖和分化的影響[D];南京醫(yī)科大學;2009年

3 雷家軒;機械力學刺激及雌激素干預(yù)對成骨樣細胞MG-63雌激素受體-α36表達影響[D];中南大學;2012年

4 龍麗;氟化鈉對體外培養(yǎng)骨細胞影響的研究[D];新疆醫(yī)科大學;2003年

5 王明朗;持續(xù)靜壓力對成骨樣細胞整合素a5和整合素β1mRNA表達的影響[D];中南大學;2007年

6 衡璐;低滲透壓對大鼠三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元GABA激活電流的抑制作用[D];華中科技大學;2007年

7 鄒毅軍;靜態(tài)牽張力下CGRP對人成骨樣細胞MMP-3及TIMP-1mRNA表達的影響[D];中南大學;2009年

8 陳筱雨;低滲透壓對大鼠三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元ATP-激活電流的抑制作用[D];華中科技大學;2007年

9 金冬梅;聯(lián)合應(yīng)用IGF-I和BMP-2促MC 3T3-E1細胞及NIH 3T3細胞增殖、分化和鈣化的效應(yīng)[D];浙江大學;2005年

10 潘建萍;激動TRPV4受體對大鼠三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元電壓依賴性鈉電流的影響[D];華中科技大學;2006年

本文編號：2738189