【摘要】：牙槽骨骨量不足可導(dǎo)致可摘義齒固位差、種植義齒修復(fù)困難等問題,因此,良好的牙槽骨骨量是修復(fù)成功的基礎(chǔ)條件之一。在臨床中,頜骨骨髓炎、頜骨囊腫、頜骨良惡性腫瘤、外傷以及缺牙區(qū)生理性的骨吸收,都可能導(dǎo)致牙槽骨量不足,這將給修復(fù)過程帶來困難,并影響修復(fù)的遠期效果。因此,尋找增加骨量的方法和途徑成為研究熱點。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(Bone morphogenetic protein,BMPs)是轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)超家族中的一員,許多器官在生長和發(fā)育的過程中都受到BMPs的調(diào)節(jié)。自1965年Urist和其他學(xué)者從脫鈣骨中提取出具有促成骨活性的蛋白質(zhì)成分以來,又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了多種骨形態(tài)發(fā)生蛋白,并發(fā)現(xiàn)其在成骨方面的重要作用。其中,BMP4對促進骨組織的形成和再生尤為重要。研究發(fā)現(xiàn)通過對骨髓間充質(zhì)干細胞(BMSCs)和手術(shù)去勢實現(xiàn)的小鼠骨質(zhì)疏松模型研究發(fā)現(xiàn),BMP4信號傳導(dǎo)活化被抑制后,出現(xiàn)了明顯的骨質(zhì)疏松現(xiàn)象,揭示BMP4信號是骨組織再生和促成骨治療方面的重要靶點;且BMP4信號具有促進成骨細胞由生長板向骨化中心的轉(zhuǎn)移,相當(dāng)于骨生長的持續(xù)動力;帶有BMP4的骨修復(fù)材料在顱骨缺損的動物模型上也有顯著的成骨優(yōu)勢。近年來,中醫(yī)藥在成骨方面的研究得到越來越多的關(guān)注,根據(jù)“腎主骨生髓”的理論,利用補腎中藥來強身健體,是中醫(yī)中藥防治骨質(zhì)疏松、促進成骨的理論基礎(chǔ)。隨著對中藥研究的深入,越來越多的具有補腎效果的中藥及中藥單體均被證實了成骨效果。但因其混合組方的應(yīng)用,其自身提取物的各種單體混合的特點,解決如何篩選出有效單體成分,進而進行靶向治療,具有重要意義。我們利用課題組前期已制備成功的pGL2-BMP4啟動子熒光素酶報告基因重組質(zhì)粒,對多種具有補腎功效的中藥單體進行促進BMP4啟動子轉(zhuǎn)錄的藥物篩選;隨后,通過western blot實驗檢測這些中藥對BMP4蛋白表達的調(diào)節(jié)作用。通過上述實驗,我們發(fā)現(xiàn),五味子丙素在促進BMP4的啟動子轉(zhuǎn)錄和蛋白表達方面效果顯著。隨后,我們設(shè)計了進一步的濃度梯度實驗,通過熒光素酶報告基因篩選和Western Blot篩選,發(fā)現(xiàn)10-8M為五味子丙素促進BMP4的啟動子轉(zhuǎn)錄和蛋白表達最佳作用濃度。進而為了驗證五味子丙素對Mc3T3-E1細胞的增殖和分化的促進作用,我們設(shè)計了MTT實驗和ALP檢測實驗。檢測發(fā)現(xiàn):在促增殖方面,給藥后的第一天和第二天,給藥組與未給藥組未見顯著差異;從第三天,給藥組的OD值明顯高于優(yōu)于未給藥組(P0.05),說明五味子丙素對Mc3T3-E1細胞具有一定的促增殖效果;在促進分化方面,以ALP作為分化的檢測指標(biāo)進行檢測,我們發(fā)現(xiàn)給藥組ALP活性均高于未給藥組,且在第三天時出現(xiàn)顯著差異(P0.05),證實了五味子丙素對Mc3T3-E1細胞具有一定的促分化效果。為了探究BMP4是否是五味子丙素促進Mc3T3-E1細胞增殖分化的作用靶點,我們進行了BMP4基因沉默實驗。我們發(fā)現(xiàn),沉默BMP4基因后,五味子丙素對促增殖的效果明顯降低,在ALP活性檢測中也得到了同樣的結(jié)果。因此,我們推測,上調(diào)BMP4表達是五味子丙素促進前成骨細胞增殖和分化的可能途徑。通過上述實驗,我們得出結(jié)論,五味子丙素可以促進BMP4啟動子轉(zhuǎn)錄和BMP4蛋白表達,其中10-8M的濃度效果最為明顯。五味子丙素可促進前成骨細胞的增殖和分化,上調(diào)BMP4表達是五味子丙素促進前成骨細胞增殖和分化的可能途徑。本實驗為應(yīng)用中藥單體進行促成骨治療的臨床應(yīng)用提供了新思路。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R78
【圖文】：

３．１邋ｐＧＬ２－ＢＭＰ４重組質(zhì)粒酶切鑒定逡逑原有的ＰＧＬ２－ＢＭＰ４重組質(zhì)粒經(jīng)過轉(zhuǎn)化擴增、小量培養(yǎng)、大量培養(yǎng)、大量提逡逑取后，進行瓊脂糖凝膠電泳鑒定。如圖４．１逡逑Ｉ逡逑／邋／逡逑圖４．１邋ｐＧＬ２－ＢＭＰ４重組質(zhì)粒酶切結(jié)果逡逑３．２中藥單體五味子丙素可促進ＭＣ３Ｔ３－Ｅ１細胞ＢＭＰ４啟動子的逡逑轉(zhuǎn)錄逡逑通過文獻查閱以及前期預(yù)實驗的初步篩選，我們利用雙熒光素酶檢測報告系逡逑統(tǒng)試劑盒對地黃苷Ｄ、蘆薈大黃素、延胡索甲素、五味子丙素、原阿片堿、姜黃逡逑素、靈傮＿Ａ、大黃酚、人參皂甘Ｒｂｌ等中藥單體進行檢測。按著說明書要求，逡逑在ＨＥＫ２９３Ｔ細胞中轉(zhuǎn)染ｐＧＬ２－ＢＭＰ４和內(nèi)參質(zhì)粒ｐＲＥＰ７－Ｒｌｕｃ；邋１６ｈ后，加入上逡逑述中藥單體，使加入藥物后孔內(nèi)的終濃度達到１０＿８Ｍ，并以ＰＢＳ作為對照，每個逡逑組設(shè)置６個平行孔；加藥后２４ｈ進行測值。我們發(fā)現(xiàn)，相較于對照組，五味子丙逡逑素、地黃苷Ｄ、靈芝酸Ａ、大黃酚等中藥單體均可以促進ＢＭＰ４啟動子的轉(zhuǎn)錄，逡逑其中以五味子丙素效果顯著（ＰＯ．０１）。見圖４．２。逡逑１６逡逑

使加入藥物后孔內(nèi)的終濃度達到１（Ｔ８Ｍ，，并以ＰＢＳ作為對照；加藥后４８ｈ收樣；逡逑以（３－ａｃｔｉｎ作為內(nèi)對照。我們發(fā)現(xiàn)，在這幾種中藥單體中，五味子丙素對ＢＭＰ４逡逑蛋白表達的促進作用最為顯著。見圖４．３。逡逑ＢＭＰ４邐—邋一、逡逑ｐ－ａｃｔｉｎ逡逑零，辨ｙ逡逑圖４．３不同中藥單體對ＢＭＰ４蛋白表達的影響逡逑３．４五味子丙素在１０＿８Ｍ濃度時促ＢＭＰ４啟動子轉(zhuǎn)錄活性效果最逡逑為明顯邐１７逡逑

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 謝晶曦,周瑾,張純貞,楊靖華,陳葭曦,金漢卿;五味子丙素類似物合成的研究[J];藥學(xué)學(xué)報;1981年04期

2 謝晶曦,周瑾,張純貞,楊靖華,陳葭曦;五味子丙素及其類似物的全合成[J];科學(xué)通報;1982年06期

3 謝晶曦,周瑾,張純貞,楊靖華,金漢卿,陳葭曦;五味子丙素類似物合成的研究—— Ⅱ.4,4′-二甲氧基-5,6,5′,6′-二次甲二氧基-2,2′-二甲氧羰基聯(lián)苯及其異構(gòu)體的合成[J];藥學(xué)學(xué)報;1982年01期

4 謝晶曦,周瑾,張純貞,楊靖華,陳葭曦;防治肝炎藥物的研究——五味子丙素及其結(jié)構(gòu)異構(gòu)體的全合成[J];中國科學(xué)(B輯 化學(xué) 生物學(xué) 農(nóng)學(xué) 醫(yī)學(xué) 地學(xué));1983年09期

5 焉石;逄世峰;金銀萍;王英平;;五味子油餅的化學(xué)成分研究[J];特產(chǎn)研究;2011年03期

6 楊博;郜紅利;;一測多評法檢測六味五靈片中6種成分的含量[J];中國藥師;2016年10期

7 童玉懿;黎蓮娘;;北五味子種子中有效成分的含量測定[J];中草藥通訊;1977年10期

8 胥春霞;劉Z

本文編號：2736813