【摘要】：1.QKI促進(jìn)hDPSCs向成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞分化研究目的:人牙髓干細(xì)胞(human dental pulp stem cells,hDPSCs)是一種間充質(zhì)來源的干細(xì)胞,具有自我更新的能力,并能夠在特定的環(huán)境下分化為具有特定功能的細(xì)胞群體,形成修復(fù)性牙本質(zhì)來防御或自我修復(fù)。Quaking(QKI)是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及RNA活化蛋白(Signal Transduction and Activator of RNA metabolism,STAR)家族的一員。作為一種RNA結(jié)合蛋白,QKI蛋白可以通過結(jié)合在靶定的目標(biāo)RNA上發(fā)揮作用。研究證明,QKI在多種生理或病理進(jìn)程中都發(fā)揮重要作用。QKI在hDPSCs向成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞(odontoblast-likecells,OLCs)分化過程中的作用還未見報(bào)道。本研究試圖探討RNA結(jié)合蛋白QKI在hDPSCs向成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞分化(簡稱成牙本質(zhì)細(xì)胞向分化)中的表達(dá)及作用。研究方法:本研究利用免疫組化檢測PN2小鼠下頜切牙中QKI蛋白的表達(dá)模式。我們在體外分離培養(yǎng)hDPSCs,并對細(xì)胞干性進(jìn)行了鑒定。在模擬hDPSCs成牙本質(zhì)細(xì)胞向分化的過程中,提取不同天數(shù)的RNA和蛋白,通過qRT-PCR和Western blot檢測QKI及其他分化相關(guān)基因的表達(dá)。同時(shí),我們利用免疫組化檢測了 QKI蛋白在成牙本質(zhì)細(xì)胞向分化過程中的定位表達(dá)。為了探索QKI在hDPSCs成牙本質(zhì)細(xì)胞向分化中的功能,分別在hDPSCs中過表達(dá)或抑制QKI,并通過qRT-PCR和Western blot檢測其在細(xì)胞分化過程中標(biāo)志性基因的表達(dá)水平,同時(shí)通過檢測堿性磷酸酶活性和礦化結(jié)節(jié)的形成來驗(yàn)證QKI對hDPSCs成牙本質(zhì)細(xì)胞向分化功能的影響。研究結(jié)果:PN2小鼠下頜切牙模型顯示QKI在前成牙本質(zhì)細(xì)胞中低表達(dá),而在分化后的成牙本質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)較高。在體外人牙髓干細(xì)胞誘導(dǎo)分化過程中,QKI表達(dá)表現(xiàn)為先上升再下降,但都高于未分化水平。免疫熒光顯示,誘導(dǎo)分化后,QKI蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng),且主要表達(dá)在誘導(dǎo)后成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的胞核內(nèi),胞漿亦有少量表達(dá)。過表達(dá)QKI可上調(diào)DMP1,DSPP和ALP mRNA和蛋白表達(dá)水平,并可促進(jìn)礦化結(jié)節(jié)的形成;沉默QKI表達(dá)可下調(diào)DMP1,DSPP和ALP mRNA和蛋白表達(dá)水平。結(jié)論:RNA結(jié)合蛋白QKI在hDPSCs中表達(dá)并在向成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞分化過程中表達(dá)上調(diào),并可以促進(jìn)hDPSCs成牙本質(zhì)細(xì)胞向分化。2.QKI作為KLF4的ceRNA促進(jìn)hDPSCs成牙本質(zhì)細(xì)胞向分化研究目的:在hDPSCs向成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞分化過程中,有多種分子機(jī)制參與調(diào)控,包括生長因子,轉(zhuǎn)錄因子,microRNA和其他信號通路等,這些分子相互聯(lián)系形成網(wǎng)絡(luò)并從不同層面上調(diào)節(jié)hDPSCs向成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞分化。CeRNA即競爭性內(nèi)源RNA,為來源于生物體內(nèi)部的編碼或非編碼RNA,通過自身的MRE與相關(guān)的microRNA結(jié)合,從而競爭性的對受共同microRNA調(diào)控的其他靶基因進(jìn)行調(diào)控,在細(xì)胞增殖分化和疾病發(fā)生中有著重要作用。本研究探究了QKI mRNA在hDPSCs向成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞分化過程中與轉(zhuǎn)錄因子KLF4 mRNA相互作用產(chǎn)生的ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其功能。研究方法:利用qRT-PCR與Western blot檢測hDPSCs向成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞分化過程中QKI和KLF4的表達(dá)趨勢。分別抑制QKI與KLF4的表達(dá)水平,檢測兩者mRNA水平及蛋白水平表達(dá)的變化。利用生物信息學(xué)方法預(yù)測在人類基因組中KLF4和QKI mRNA是否存在互為ceRNA的可能性,并篩選出它們可能共享的miRNAs。在hDPSCs中過表達(dá)這些miRNAs,Western blot檢測QKI和KLF4蛋白的表達(dá),并利用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證共享的miRNAs與QKI和KLF4確實(shí)能夠結(jié)合。最后,利用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證QKI和KLF4之間的調(diào)控關(guān)系具有miRNA依賴性。研究結(jié)果:QKI和KLF4在hDPSCs向成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞分化中具有相同的表達(dá)模式。抑制QKI的表達(dá)能夠顯著下調(diào)KLF4的表達(dá)水平,反之亦然。生物信息學(xué)預(yù)測QKI和KLF4共享的miRNA,通過Western blot和熒光素酶活性實(shí)驗(yàn)證明,mir-124-3p,mir-128-3p,mir-145-5p和mir-429可以同時(shí)結(jié)合QKI和KLF4的3'-UTR區(qū)并抑制其表達(dá)。下調(diào)QKI的表達(dá)能夠顯著抑制KLF43'-UTR區(qū)的熒光素酶活性,同樣下調(diào)KLF4的表達(dá)能夠顯著抑制QKI3'-UTR區(qū)熒光素酶活性,而當(dāng)突變這些共享miRNA的結(jié)合位點(diǎn)時(shí),這種調(diào)控作用消失。結(jié)論:QKI mRNA和KLF4 mRNA互為ceRNA,通過競爭性的結(jié)合mir-124-3p,mir-128-3p,mir-145-5p和mir-429促進(jìn)hDPSCs向成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞分化。3.QKI作為RNA結(jié)合蛋白促進(jìn)hDPSCs成牙本質(zhì)細(xì)胞向分化研究目的:QKI蛋白屬于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及RNA活化蛋白家族,是一種在進(jìn)化上高度保守的RNA結(jié)合蛋白,主要發(fā)揮調(diào)節(jié)RNA代謝和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的功能。QKI可以通過結(jié)合于pre-mRNA或成熟mRNA上發(fā)揮作用,在促進(jìn)細(xì)胞的分化中起到重要的作用,同時(shí)也會影響人類疾病的發(fā)生發(fā)展。本研究旨在探索QKI除作為KLF4的ceRNA發(fā)揮作用外,是否可以通過RNA結(jié)合蛋白相關(guān)的調(diào)控機(jī)制,促進(jìn)hDPSCs向成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞的分化過程。研究方法:利用生物信息學(xué)方法,預(yù)測在人類基因組中成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞分化關(guān)鍵基因上是否存在QKI蛋白的結(jié)合位點(diǎn)。利用RNA結(jié)合蛋白免疫沉淀(RIP)實(shí)驗(yàn)檢測QKI和DSPPmRNA能否直接結(jié)合。利用siRNA抑制QKI的表達(dá)并加入放線菌素D抑制細(xì)胞內(nèi)mRNA的轉(zhuǎn)錄,qRT-PCR檢測DSPPmRNA的半衰期。研究結(jié)果:生物信息學(xué)分析了 Collagen I、SIBLING家族等成牙本質(zhì)細(xì)胞分化相關(guān)基因,發(fā)現(xiàn)在DSPPmRNA蛋白編碼區(qū)上存在QKI的結(jié)合位點(diǎn),并且通過RIP實(shí)驗(yàn)證明QKI蛋白可以富集DSPP mRNA。半衰期實(shí)驗(yàn)證實(shí)QKI結(jié)合于DSPPmRNA后,可以增強(qiáng)其穩(wěn)定性,間接增加DSP蛋白的表達(dá)。結(jié)論:QKI蛋白可以結(jié)合于DSPPmRNA的蛋白編碼區(qū)并增強(qiáng)其穩(wěn)定性,發(fā)揮其RNA結(jié)合蛋白的功能,促進(jìn)hDPSCs向成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞分化。
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R78
【圖文】：

Ｑｕａｋｉｎｇ促進(jìn)人牙毮丨＇－細(xì)胞成牙木質(zhì)向分化的作ＩＩＪ邐逡逑此外，還有研宄證明ＱＫＩ蛋白可以通過改變與內(nèi)吞溶酶體形成和降解相關(guān)的蛋白逡逑ＲＮＡ穩(wěn)態(tài)，改變內(nèi)吞溶酶體的數(shù)量，對膠質(zhì)干細(xì)胞千性的維持產(chǎn)生作用（Ｓｈｉｎｇｕｅｔ逡逑ｌ．，２０１７）。逡逑ｕｃ

圖１－１．邋ｈＤＰＳＣｓ鑒定

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1 李舒晨;Quaking促進(jìn)人牙髓干細(xì)胞向成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞分化的作用[D];武漢大學(xué);2018年

本文編號：2735562