【摘要】： 目的 牙種植體作為植入體內(nèi)的醫(yī)用裝置,已成為修復牙列缺損和牙列缺失的主要治療手段之一。種植材料的表面性狀和形態(tài)可影響種植后的生存質量,決定組織細胞在其表面的粘附、增殖和分化,對種植體的初期穩(wěn)定性和遠期固持率發(fā)揮十分重要的作用。鈦以其優(yōu)良的生物相容性、力學性能、耐腐蝕性和良好的可加工性在牙種植領域中得以廣泛應用。但是鈦也有它自身的缺點。鈦基本屬于生物惰性材料,不能與骨組織形成生物性結合從而獲得理想的骨整合,同時鈦自身不具備抗菌性能,在植入及修復后易出現(xiàn)菌斑堆積于鈦種植體周圍。為解決這一問題,許多學者利用表面改性技術,對金屬鈦表面進行活化處理,賦予金屬材料生物功能性,在獲得骨整合方面取得了理想的效果。然而針對提高種植材料抗菌性能的研究卻相對較少。 大量統(tǒng)計結果證實,臨床上種植體的松動、脫落,相當一部分原因是由于種植體頸部菌斑堆積,致病菌通過其菌體表面物質、產(chǎn)生的毒素及代謝產(chǎn)物等破壞種植體周圍軟組織封閉屏障以及骨性結合界面,導致種植體周圍炎并最終出現(xiàn)骨性結合界面喪失,種植失敗。牙齦卟啉單胞菌是目前公認的種植體周圍炎的主要可疑致病菌之一,因此,對牙齦卟啉單胞菌粘附和增殖的控制是預防種植體周圍炎的關鍵。 種植材料對成骨細胞行為的影響是多層面的。在細胞水平上,它可以影響細胞的形態(tài)、粘附、增殖、遷移和分化等;在分子水平上,它可以影響細胞的骨相關基因的表達。有很多研究已經(jīng)證實植入材料的表面化學成分、表面物理形貌都會對成骨細胞的生物學行為產(chǎn)生影響。在評估種植材料的生物活性時,一個重要指標就是觀察改性材料是否能促進組織細胞在其表面早期大量附著并形成良好的細胞形態(tài),形態(tài)上的變化是啟動一系列細胞行為的生物信號。成骨細胞在種植材料表面的早期粘附和增殖是成骨細胞進一步分泌細胞外基質、合成相關蛋白、礦化成骨及表達成骨細胞生物合成功能的基礎。細胞的粘附過程和細胞的信號傳導通路有關,粘著斑的形成是成熟細胞信號傳導的前提。整合素與細胞外基質結合,再與粘著斑形成復合物,傳導細胞外基質以及生長因子的信號,引起細胞骨架的變化,繼而引起細胞的形態(tài)及一系列功能變化。Ⅰ型膠原是骨組織中最重要的分子標記,因而檢測Ⅰ型膠原的形成和表達可作為生物材料生物學潛能的判斷依據(jù)。 在生物陶瓷涂層眾多問題尚未解決的情況下,利用離子注入技術改變鈦種植體表面的物理形貌和化學狀態(tài)以提高其生物相容性成為目前研究的熱點。等離子體浸沒離子注入技術作為一種全方位的離子注入技術,近年來受到國內(nèi)外學者的廣泛重視并逐漸應用于生物學領域。氟作為機體生命活動所必須的微量元素之一,對全身骨骼生長發(fā)育和維持骨骼生理結構功能具有重要作用。同時,氟化物具有良好的抗菌性能。本實驗應用等離子體浸沒離子注入技術,將氟離子引入光滑商業(yè)純鈦表面,并通過微觀分析方法,對其表面的化學組成和物理結構進行綜合評價。將牙齦卟啉單胞菌和成骨細胞分別接種于氟離子注入純鈦前后的材料表面,建立細菌與材料界面間、細胞與材料界面間的直接接觸關系,綜合評價通過等離子體浸沒離子注入技術對純鈦表面進行氟離子注入后改性材料的抗菌性能及其對成骨細胞生物學行為的影響,為探索同時具有良好的生物相容性和抗菌性能的種植材料提供一種具有應用前景的材料改性方法。 方法 一、氟離子注入鈦表面及其微觀分析 1、氟離子注入純鈦表面改性材料的制備 將商業(yè)純鈦基體材料加工成直徑為10mm、厚度為1mm的鈦片,表面經(jīng)機械研磨、拋光至鏡面后將其分為兩組,進行氟離子注入的鈦片為實驗組,未進行氟離子注入的鈦片為對照組。應用哈爾濱工業(yè)大學現(xiàn)代焊接生產(chǎn)技術國家重點實驗室自主研發(fā)的第三代等離子體浸沒離子注入裝置進行氟離子注入,CF4為離子注入源。 2、化學組成和物理形貌的分析 應用PHI-5700 ESCA型X線光電子能譜分析系統(tǒng)進行改性材料表面化學元素組成的分析,并通過高斯擬合顯示各元素的化學狀態(tài);應用掃描電鏡觀察氟離子注入前后材料表面物理形貌的變化。 3、氟離子釋放濃度的測定 采用氟離子選擇電極法測量不同氟離子注入時間的改性材料樣品單位時間內(nèi)釋放的氟離子濃度。 二、氟離子注入鈦表面改性材料的抗菌性能 1、抑菌實驗 采用改性材料表面直接細菌培養(yǎng)法,通過倍比稀釋各樣本后接種培養(yǎng),菌落計數(shù)觀察氟離子注入前后鈦片表面對牙齦卟啉單胞菌的抑制作用。 2、牙齦卟啉單胞菌的掃描電鏡觀察 應用掃描電鏡觀察牙齦卟啉單胞菌在氟離子注入前后鈦片表面的形態(tài)變化。 三、氟離子注入鈦表面改性材料對成骨細胞生物學行為的影響 (一)細胞毒實驗 將成骨樣細胞MG-63制成5×10~3 cells/ml的細胞懸液,接種于96孔板中,細胞貼壁后,以改性材料浸提液替換原培養(yǎng)液。分別培養(yǎng)24小時、48小時、72小時后,MTT法檢測改性材料對成骨細胞增殖的影響。 (二)成骨細胞粘附和增殖實驗 1、掃描電鏡 通過掃描電鏡觀察MG-63在氟離子注入前后鈦片表面的形態(tài)變化。 2、丫啶橙染色 丫啶橙染色法檢測MG-63在氟離子注入前后鈦片表面粘附和增殖的數(shù)量。 3、PI單染法流式細胞儀 應用PI單染法流式細胞儀分析MG-63在氟離子注入前后鈦片表面的細胞周期變化。 (三)成骨細胞粘著斑形成的測定 接種到氟離子注入前后鈦片表面的MG-63分別培養(yǎng)6小時、24小時、48小時后,應用免疫熒光法觀察氟離子注入純鈦改性材料表面MG-63粘著斑的形成,激光共聚焦顯微鏡觀察并攝片,測量細胞熒光強度,計數(shù)粘著斑形成數(shù)量。 (四)、成骨細胞Ⅰ型膠原形成和表達的測定 1、免疫熒光法檢測Ⅰ型膠原的形成 接種到氟離子注入前后鈦片表面的MG-63分別培養(yǎng)6小時、24小時、48小時后,應用免疫熒光法觀察MG-63Ⅰ型膠原的形成,激光共聚焦顯微鏡觀察并攝片,測量細胞熒光強度,計數(shù)Ⅰ型膠原形成的數(shù)量。 2、逆轉錄聚合酶鏈反應檢測Ⅰ型膠原mRNA的表達 接種到氟離子注入前后鈦片表面的MG-63分別培養(yǎng)6小時、24小時、48小時后,收集細胞,提取并檢測總RNA,合成第一鏈cDNA,PCR擴增Ⅰ型膠原和β-actin,瓊脂糖凝膠電泳分析改性材料對Ⅰ型膠原mRNA的表達的影響。 3、蛋白印跡法檢測Ⅰ型膠原蛋白的表達 接種到氟離子注入前后鈦片表面的MG-63分別培養(yǎng)6小時、24小時、48小時后,收集細胞,提取細胞總蛋白并定量,SDS凝膠電泳,轉膜并封閉后,抗原抗體雜交孵育,顯色后凝膠成像儀分析改性材料對Ⅰ型膠原蛋白表達的影響。 結果 一、氟離子注入鈦表面改性材料的微觀分析 1、改性層的化學組成 XPS寬程掃描分析顯示,氟離子注入后材料表面主要為鈦、氧、氟、碳四種元素,比純鈦表面新增了氟元素的信號,且隨著氟離子注入時間的增加氟信號逐漸增強,鈦的信號也隨之增強,氧信號因逐漸被增強的氟信號所掩蓋而減弱。高斯擬合結果顯示氟離子注入前樣品表面的Ti2p3/2峰位置在458.5eV處,可歸結為二氧化鈦;注入后樣品表面在約458.7eV及459.9eV處都出現(xiàn)Ti2p3/2峰,分別歸結為二氧化鈦及三氟化鈦。 2、改性層的表面形貌 氟離子注入后,材料表面形成許多均勻分布的、散在的團粒狀物質,大部分嵌入基體組織中,少量突出于材料表面,并且隨著氟離子注入時間的延長,沉積于改性層表面的團粒數(shù)量逐漸增多,且團粒之間有大小較均勻的孔隙存在。從20000倍掃描電鏡照片可以看出,氟離子注入7小時組表面沉積的團粒大小和形狀更加均勻一致,邊界更加清晰。 3、氟離子釋放 材料氟離子的釋放小于0.10mg/L的檢出極限。 二、氟離子注入鈦表面改性材料對牙齦卟啉單胞菌的抑制作用 1、菌落計數(shù) 氟離子注入組鈦片表面牙齦卟啉單胞菌菌落的數(shù)量明顯少于純鈦表面,具有顯著性差異(P＜0.01);且隨著氟離子注入時間的延長,其表面的菌落數(shù)量減少明顯,除F-Ti-5h組與F-Ti-7h組外(P＜0.05),不同氟離子注入時間的各組之間具有顯著性差異(P＜0.01)。 2、氟離子注入鈦表面對牙齦卟啉單胞菌粘附和菌體形態(tài)的影響 在純鈦表面粘附的牙齦卟啉單胞菌數(shù)量較多,菌細胞分散且大多為單個生長,菌細胞形態(tài)規(guī)則,邊緣光滑呈球桿狀,為正常菌體形態(tài);而氟離子注入后,改性材料表面牙齦卟啉單胞菌粘附的數(shù)量較純鈦表面減少且出現(xiàn)菌細胞形態(tài)變異。 三、氟離子注入鈦表面改性材料對成骨細胞生物學行為的影響 (一)MTT法分析結果 氟離子注入組鈦片表面成骨樣細胞MG-63的細胞增殖數(shù)量明顯多于對照組純鈦表面,具有顯著性差異(P＜0.01);并且隨著氟離子注入時間的延長增殖數(shù)量明顯增多,不同氟離子注入時間的各組之間具有顯著性差異(P＜0.01)。但培養(yǎng)72小時后,F-Ti-7h樣品表面的細胞增殖數(shù)量則與F-Ti-Sh之間無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。 (二)改性材料對成骨細胞粘附和增殖的影響 1、掃描電鏡觀察細胞形態(tài) 純鈦表面MG-63大多為多邊形或圓形,伸展不十分良好。氟離子注入鈦表面的成骨細胞伸展良好,以多個細長的突起牢固的粘附于基底材料的表面,并且,隨著氟離子注入時間的延長,鈦片表面成骨細胞的密度有增加的趨勢,伸出細長的偽足與周邊的細胞形成良好的交通。 2、細胞的粘附與增殖 所有材料表面粘附和增殖的MG-63細胞數(shù)隨培養(yǎng)時間的延長而增加。培養(yǎng)后6小時,各組材料表面細胞數(shù)量無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。培養(yǎng)至24小時后,氟離子注入純鈦組表面的細胞數(shù)比未注入的純鈦組多,具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);但是F-Ti-7h樣品表面的細胞粘附數(shù)量與F-Ti-5h之間無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。 3、流式細胞儀分析細胞周期 MG-63細胞接種48小時后,氟離子注入組與未注入組表面細胞的G_0/G_1和G_2/M期的比例無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。氟離子注入組細胞S期的比例明顯高于未注入之純鈦組,且隨著氟離子注入時間的增加而增加(P＜0.05)。在DNA直方圖上,在G1峰前未出現(xiàn)凋亡峰。 (三)改性材料表面成骨細胞粘著斑的形成 氟離子注入前后鈦片表面MG-63的細胞膜上均可見綠色點狀或簇狀的紐蛋白熒光染色。定量對比顯示,粘著斑形成的數(shù)量隨培養(yǎng)時間的延長逐漸增加;培養(yǎng)6小時后,氟離子注入組材料表面的粘著斑形成數(shù)量比純鈦組表面形成的多,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);培養(yǎng)至24小時后,兩種材料表面均有大量的粘著斑形成,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。 (四)改性材料表面成骨細胞Ⅰ型膠原的形成和表達 1、成骨細胞Ⅰ型膠原的形成 材料表面Ⅰ型膠原形成的數(shù)量隨培養(yǎng)時間的延長逐漸增加。熒光強度的定量對比顯示,培養(yǎng)6小時、24小時后,氟離子注入組材料表面的Ⅰ型膠原蛋白形成數(shù)量明顯多于純鈦組表面,有顯著性差異(P＜0.01);48小時后,氟離子注入組材料表面的Ⅰ型膠原蛋白形成數(shù)量比純鈦組表面多,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。 2、材料表面成骨細胞Ⅰ型膠原mRNA的表達 兩組材料表面Ⅰ型膠原mRNA表達均為陽性。隨著培養(yǎng)時間的延長,兩組材料表面成骨細胞分泌的Ⅰ型膠原mRNA量均逐漸增加,且氟離子注入組材料表面的Ⅰ型膠原mRNA表達較純鈦組表面的多,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。 3、材料表面成骨細胞Ⅰ型膠原蛋白的表達 兩組材料表面培養(yǎng)均能檢測到Ⅰ型膠原蛋白的表達,隨著培養(yǎng)時間的延長,兩組材料表面成骨細胞分泌的Ⅰ型膠原蛋白量均逐漸增加,且氟離子注入組材料表面的Ⅰ型膠原蛋白表達較純鈦組表面的多,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。 結論 1、氟離子注入純鈦后,其表面化學元素主要為氧、鈦、氟和碳;其化學組成主要為二氧化鈦和三氟化鈦。 2、氟離子注入后,材料表面形成許多均勻分布的、散在的團粒狀物質。 3、氟離子釋放量低于0.10mg/L的檢出極限。 4、氟離子注入純鈦表面改性材料具有抑制P.g生長的性能。 5、氟離子注入純鈦表面改性材料可抑制P.g的粘附并影響其菌體形態(tài)。 6、氟離子注入純鈦表面改性材料沒有細胞毒性。 7、氟離子注入純鈦表面改性材料利于成骨細胞在其表面的粘附和增殖。 8、氟離子注入組材料表面成骨細胞粘著斑形成的數(shù)量明顯多于純鈦組,差異有統(tǒng)計學意義。 9、氟離子注入組材料表面成骨細胞Ⅰ型膠原蛋白形成的數(shù)量明顯多于純鈦組,差異有統(tǒng)計學意義。 10、氟離子注入組材料表面材料成骨細胞Ⅰ型膠原mRNA和Ⅰ型膠原蛋白的表達明顯高于純鈦組表面,差異有顯著性。
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R783.1
【圖文】：

3、實驗設備離子注入裝置為哈爾濱工業(yè)大學現(xiàn)代焊接生產(chǎn)技術國家重點實驗室自主研發(fā)的第三代等離子體浸沒離子注入裝置，見圖1。xPS分析儀為PHI一 5700ESCA型X線光電子能譜分析系統(tǒng)。掃描電鏡為JSM一300型掃描電鏡。氟離子選擇電極及PHS一3型數(shù)顯酸度計。

氟離子注入后材料表面仍然有微小裂隙的存在，裂隙數(shù)量與氟離子注入前未見明顯變化。從 20000倍掃描電鏡照片可以看出，氟離子注入7小時組表面沉積的團粒大小和形狀更加均勻一致，邊界更加清晰。見圖4。三、氟離子釋放本實驗條件下，材料氟離子的釋放小于0.10mg/L的檢出極限。

【引證文獻】

相關碩士學位論文 前2條

1 張杰;胰島素對2型糖尿病大鼠種植體周圍骨組織TGF-β1表達的研究[D];山西醫(yī)科大學;2012年

2 趙夢鯉;離子束誘導碳納米管功能化對其生物相容性影響的研究[D];天津師范大學;2012年

本文編號：2734439