發(fā)布時(shí)間：2020-06-26 03:34

【摘要】：人牙周膜干細(xì)胞(Human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs)是一種位于牙周膜內(nèi)的具有分化為成骨樣細(xì)胞、成牙骨質(zhì)樣細(xì)胞、脂肪細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞等各種功能細(xì)胞的間充質(zhì)干細(xì)胞,被視為牙周組織工程最有潛力的種子細(xì)胞。如何促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞的增殖和成骨分化已經(jīng)成為牙周組織再生領(lǐng)域研究的熱點(diǎn),雌激素因其在人體骨骼系統(tǒng)中的重要作用被廣泛研究,但副作用限制了其臨床應(yīng)用。依普黃酮(Ipriflavone,IP)是一種已廣泛應(yīng)用于臨床的植物性雌激素類藥物,屬于異黃酮衍生物,可直接作用于骨組織、抑制骨吸收,且同時(shí)兼有雌激素和降鈣素的治療作用,由于其機(jī)理為體內(nèi)的生理代謝過程,因此并不具備雌激素所產(chǎn)生的各種副反應(yīng),具有良好的應(yīng)用前景。雌激素受體包括經(jīng)的雌激素α受體、β受體以及近年來最新發(fā)現(xiàn)的G蛋白偶聯(lián)雌激素受體(G protein-coupled estrogen receptor,GPER),又名 GPR30,是一種7次跨膜G蛋白偶聯(lián)受體。有研究指出GPR30可與雌激素結(jié)合后通過多種非基因途徑快速介導(dǎo)包括離子通道、激酶的激活以及各種信號(hào)通路激活在內(nèi)的多種細(xì)胞內(nèi)反應(yīng),例如 MAPK/Erk(Mitogen-activated protein kinases/extracellular regulated protein kinases)信號(hào)通路、cAMP(Cyclic adenosine monophosphate)信號(hào)通路、PI3K/Akt(Phosphatidylinositol 3-kinase/protein Kinase B)信號(hào)通路等,而這些被激活的信號(hào)通路在骨改建過程中也起著舉足輕重的作用。LY294002是PI3K/Akt信號(hào)通路的特異性抑制劑,屬于槲皮素的嗎啉代衍生物,目前已用于多項(xiàng)研究,可為PI3K/Akt信號(hào)通路參與各種生物調(diào)節(jié)反應(yīng)提供有力的證據(jù)。目的:本研究旨在探討依普黃酮對(duì)體外培養(yǎng)條件下的人牙周膜干細(xì)胞的增殖和成骨分化的影響,并在篩選其最佳濃度后探索PI3K/Akt信號(hào)通路和GPR30在依普黃酮促進(jìn)人牙周膜干細(xì)胞成骨分化過程中的作用。最后通過大鼠正畸牙移動(dòng)復(fù)發(fā)模型的建立探討依普黃酮對(duì)正畸牙移動(dòng)復(fù)發(fā)過程中骨改建的影響,為依普黃酮在正畸臨床的應(yīng)用可行性提供理論實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法:(1)體外分離培養(yǎng)hPDLSCs:采用組織塊法從12～18歲因正畸治療需要而拔除的健康前磨牙上分離培養(yǎng)原代hPDLSCs,取3～6代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。(2)細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒(Cell-counting kit-8,CCK-8)和堿性磷酸酶(Alkaline phosphatase,ALP)活性試劑盒檢測(cè)依普黃酮對(duì)牙周膜干細(xì)胞增殖和成骨分化的影響并篩選藥物最佳濃度。(3)平板克隆形成實(shí)驗(yàn)和茜素紅染色用于再次驗(yàn)證所篩濃度依普黃酮對(duì)hPDLCs增殖和成骨分化的促進(jìn)作用。(4)Western Blot和RT-PCR檢測(cè)ALP,Runx2(Runt related transcription factor 2)和GPR30的蛋白水平和mRNA水平的表達(dá)。通過Western Blot檢查Akt和p-Akt的表達(dá)水平觀察PI3K/Akt信號(hào)通路在此過程中的變化。(5)應(yīng)用LY294002(PI3K信號(hào)通路抑制劑)和靶向GPR30 mRNA的小干擾RNA(siGPR30)用于驗(yàn)證GPR30介導(dǎo)的PI3K/Akt途徑在該過程中的功能。。(6)通過建立大鼠正畸牙移動(dòng)復(fù)發(fā)模型,探討依普黃酮應(yīng)用于促進(jìn)正畸牙移動(dòng)復(fù)發(fā)骨改建過程的可行性。采用蘇木精-伊紅染色法(Hematoxylin and eosin staining,HE)檢測(cè)牙根間牙周組織形態(tài)學(xué)變化,采用免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(Bonemorphogenicprotein,BMP2)對(duì)骨重建的影響。(7)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行分析,兩組數(shù)據(jù)之間的比較采用t檢驗(yàn),兩組數(shù)據(jù)不同時(shí)間點(diǎn)之間的比較采用配對(duì)t檢驗(yàn),多組數(shù)據(jù)之間的比較則采用單因素方差分析,P0.05視為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果:在體外條件下,10-7mol/L依普黃酮顯著促進(jìn)hPDLCs的增殖、ALP活性、集落形成效率和礦物質(zhì)沉積(P0.05)。ALP,Runx2,GPR30和p-Akt的基因表達(dá)均相比于對(duì)照組上調(diào)(P0.05)。LY294002的應(yīng)用阻斷了IP對(duì)ALP和Runx2的促進(jìn)作用;且siGPR30干擾GPR30表達(dá)后,PI3K/Akt信號(hào)通路的激活被抑制。此外,HE染色和免疫組化染色結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,IP組牙周組織中具有更多的新骨形成。結(jié)論:(1)依普黃酮可以顯著促進(jìn)人牙周膜干細(xì)胞的增殖和成骨分化,且體外最佳濃度為10-7mol/L;(2)GPR30介導(dǎo)的PI3K/Akt信號(hào)通路在依普黃酮促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞成骨分化的過程中起著重要作用;(3)依普黃酮可以顯著促進(jìn)正畸牙移動(dòng)復(fù)發(fā)過程中的牙周組織骨改建,降低正畸牙移動(dòng)的復(fù)發(fā)速率。
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R781.4
【圖文】：

圖１邋Ａ：原代培養(yǎng)的ｈＰＤＬＣｓ，第７ｄ，１０0ｘ邋Ｂ：邋ｈＰＤＬＣｓ傳代后，第三代，１０0ｘ邋Ｃ：免逡逑疫熒光顯示波形蛋白表達(dá)陽性２０0ｘ邋Ｄ：免疫熒光顯示角形蛋白表達(dá)陰性２０0ｘ邋Ｅ：逡逑ｈＰＤＬＣｓ形成的細(xì)胞團(tuán)簇，４0ｘ邋Ｆ：茜素紅染色２０0ｘ邋Ｇ：油紅０染色２０0ｘ逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１邋Ａ：邋ｈＰＤＬＣｓ邋ｇｒｅｗ邋ｒａｄｉａｌｌｙ邋ａｒｏｕｎｄ邋ｔｈｅ邋ｔｉｓｓｕｅ邋ｂｌｏｃｋ邋４0ｘ邋Ｂ：邋ｃｅｌｌ邋ｇｒｅｗ邋ｗｅｌｌ邋ａｆｔｅｒ逡逑

圖４在蛋白質(zhì)水平（Ａ）和ｍＲＮＡ水平（Ｂ）中，依普黃酮均增加ＡＬＰ，Ｒｕｎｘ２，逡逑ＧＰＲ３０的表達(dá)水平。（Ｃ）邋ｐ－ＡＫＴ表達(dá)升高而ＡＫＴ總蛋白表達(dá)不變證明ＰＩ３Ｋ逡逑／Ａｋｔ信號(hào)通路被依普黃酮激活＊Ｐ＜０．０５；邋＊＊邋Ｐ＜０．０１；邋＊＊＊邋Ｐ０．００１逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋４邋Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｏｆ邋ＡＬＰ？邋Ｒｕｎｘ２，邋ＧＰＲ３０邋ｗｅｒｅ邋ａｌｌ邋ｉｎｃｒｅａｓｅｄ邋ｂｙ邋ＩＰ邋ｉｎ邋ｂｏｔｈ邋ｐｒｏｔｅｉｎ逡逑

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本文編號(hào)：2729763