發(fā)布時間：2020-06-24 21:25

【摘要】： 目的 牙周炎是人類口腔的重要疾病,在我國有著較高的患病率,它是一種以牙周微生物為始動因子、宿主免疫防御反應參與的復雜的多因素疾病。牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.g)是一種革蘭氏陰性的厭氧菌,是目前公認的牙周炎可疑致病菌,但其致病機制尚未十分明確。牙齦上皮細胞(gingival epithelialcell,GEC)位于粘膜表面,是各種致病菌首先接觸的細胞類型。牙齦卟啉單胞菌與牙齦上皮細胞之間的相互作用一直是牙周炎病因?qū)W研究的熱點�；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metallo proteinases,MMPs)能直接參與牙周組織的破壞降解,在牙周病發(fā)生發(fā)展的病理生理過程中發(fā)揮作用,牙周炎的嚴重程度和某些MMPs正相關(guān)。此外,牙周炎發(fā)生時,在可能參與牙槽骨破壞吸收的多種細胞因子中,腫瘤壞死因子α(FNF-α)、白介素-6(IL-6)、白介素-8(IL-8)、白介素-1β(IL-1β)等起了關(guān)鍵作用。它們不僅直接導致牙周組織破壞,還進一步影響宿主的炎癥和免疫反應進程。因此,本實驗通過研究牙齦卟啉單胞菌感染牙齦上皮細胞后細胞因子表達水平的變化及基質(zhì)金屬蛋白酶的表達變化,同時研究TNF-α對基質(zhì)金屬蛋白酶表達的調(diào)節(jié),用以探討牙齦卟啉單胞菌在牙周炎發(fā)生發(fā)展中的作用機制,并為闡述牙齦上皮細胞在局部免疫反應中的作用提供證據(jù),同時為牙周炎的診斷、預防和治療提供新的思路。 方法 1、細菌培養(yǎng):將牙齦卟啉單胞菌ATCC33277株接種于含有酵母浸出物的培養(yǎng)基中,置于厭氧培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng),48h后達到對數(shù)期備用。 2、細胞培養(yǎng):取實驗室凍存的第3代牙齦上皮細胞進行復蘇后加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中,置37℃CCO_2孵箱中培養(yǎng)。取7-10代牙齦上皮細胞,分別接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中,將牙齦卟啉單胞菌與牙齦上皮細胞按100:1的比例接種于上述培養(yǎng)液中。 3、細胞因子檢測:應用ELISA方法檢測牙齦卟啉單胞菌接種前、接種后1h、3h、6h、12h、24h培養(yǎng)液上清中TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β的表達水平,同時提取培養(yǎng)液中牙齦上皮細胞總RNA,應用RT-PCR方法檢測細菌接種前、接種后1h、3h、6h、12h、24h上述細胞因子表達水平。 4、基質(zhì)金屬蛋白酶檢測:采用Western blotting檢測牙齦卟啉單胞菌感染前后牙齦上皮細胞表達MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-9的水平變化。進一步采用實時定量PCR方法檢測MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-9的mRNA水平變化情況。 5、TNF-α上調(diào)MMP-2和MMP-9表達檢測:取三種不同濃度的TNF-α作用于牙齦上皮細胞,用實時定量PCR檢測TNF-α加入前、加入后牙齦上皮細胞MMP-2和MMP-9的表達。使用抗TNF-α中和性抗體處理經(jīng)牙齦卟啉單胞菌感染過的牙齦上皮細胞后,檢測MMP-2和MMP-9的表達。 結(jié)果 1、牙齦卟啉單胞菌對牙齦上皮細胞表達TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β的影響 ELISA結(jié)果:未經(jīng)感染的牙齦上皮細胞上清液中未檢測出TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β;經(jīng)牙齦卟啉單胞菌感染后1、3、6、12及24小時,細胞上清液中檢測出TNF-α,分別為11.2±1.7pg/ml、26.7±6.4pg/ml、45.2±11.3pg/ml、82.6±16.4pg/ml和128.3±21.3pg/ml;IL-1β分別為14.6±2.3pg/ml、31.4±7.9pg/ml、50.5±9.8pg/ml、72.4±14.7pg/ml和92.6±16.8pg/ml;IL-6分別為3.4±0.4pg/ml、8.3±1.1pg/ml、12.6±1.3pg/ml、23.2±3.3pg/ml和35.3±5.7pg/ml;IL-8分別為5.7±0.6pg/ml、9.4±1.3pg/ml、22.4±2.8pg/ml、34.7±4.2pg/ml和52.3±5.3pg/ml。檢測以上細胞因子濃度均以時間依賴的方式增加(P＜0.01)。 RT-PCR結(jié)果:未經(jīng)感染的牙齦上皮細胞中未檢測出TNF-αmRNA、IL-6mRNA、IL-8mRNA、IL-1βmRNA表達;經(jīng)牙齦卟啉單胞菌感染后的牙齦上皮細胞均檢測到上述細胞因子mRNA表達,其中TNF-αmRNA、IL-1βmRNA于感染后6小時表達最為顯著,IL-6mRNA、IL-8mRNA于感染后12小時表達最為顯著。 2、牙齦卟啉單胞菌對牙齦上皮細胞表達MMP-2、MMP-3、MMP-7、MMP-9的影響 Western blotting檢測結(jié)果:未被感染的牙齦上皮細胞存在MMP-2、MMP-9較弱表達;經(jīng)牙齦卟啉單胞菌感染后的牙齦上皮細胞內(nèi)MMP-2、MMP-9蛋白表達顯著增加,其中MMP-2于感染6小時后增加最為顯著,MMP-9于感染12小時后增加最為顯著。未被感染的牙齦上皮細胞及經(jīng)牙齦卟啉單胞菌感染后的牙齦上皮細胞內(nèi)均未檢測出MMP-3和MMP-7蛋白表達。 Real-timePCR結(jié)果:未被感染的牙齦上皮細胞內(nèi)存在較低含量的MMP-2mRNA和MMP-9mRNA;經(jīng)牙齦卟啉單胞菌感染后的牙齦上皮細胞內(nèi)MMP-2mRNA含量顯著增加(P＜0.01),分別為未感染細胞的1.4、4.5、8.7、8.4和4.9倍,其中感染6小時后增加最為顯著。經(jīng)牙齦卟啉單胞菌感染后的牙齦上皮細胞內(nèi)MMP-9 mRNA含量也顯著增加(P＜0.01),分別為未感染細胞的2.3、6.6、10.8、12.5和7.2倍,其中感染12小時后增加最為顯著;未被感染的牙齦上皮細胞及經(jīng)牙齦卟啉單胞菌感染后的牙齦上皮細胞內(nèi)均未檢測出MMP-3和MMP-7mRNA表達。 3、TNF-α對牙齦上皮細胞表達MMP-2、MMP-9的調(diào)節(jié)作用 Real TimePCR結(jié)果:牙齦上皮細胞MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA表達均出現(xiàn)TNF-α劑量依賴性上調(diào)(P＜0.01),TNF-α濃度為10ng/ml時表達最多;同時結(jié)果顯示,MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA表達在TNF-α作用3小時后增加最為顯著;在10ng/ml TNF-α作用3小時后,MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA表達分別增加了20.8倍和36.7倍。經(jīng)抗TNF-α抗體處理后,各時間段MMP-2 mRNA和MMP-9 mRNA表達水平均明顯降低(P＜0.01)。 結(jié)論 1、牙齦卟啉單胞菌作用于牙齦上皮細胞后能顯著增強TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8的表達。 2、牙齦卟啉單胞菌作用于牙齦上皮細胞后能顯著增強MMP-2、MMP-9的表達,但對MMP-3、MMP-7的表達影響不大。 3、TNF-α可顯著提高牙齦上皮細胞表達MMP-2、MMP-9。
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2009
【分類號】：R781.42
【圖文】：

且于感染后6小時表達最為顯著(圖4)。幾一 lp178bP GAPDH309bP圖4，采用RT一PCR檢測未被感染的牙釀上皮細胞(0小時)及經(jīng)牙齲葉琳單胞菌感染后1、3、6、12及24小時的牙釀上皮細胞IL一 lpmRNA表達情況。3、牙跟葉琳單胞菌對牙釀上皮細胞IL一6表達的影響 (1)ELISA檢測結(jié)果采用ELISA法對未被感染的牙跟上皮細胞(對照)及經(jīng)牙釀葉琳單胞菌感染后1、3、6、12及24小時的牙釀上皮細胞培養(yǎng)上清中IL一6濃度進行檢測。結(jié)果顯示:未經(jīng)感染的牙釀上皮細胞上清液中未檢測出IL一6:經(jīng)牙跟葉琳單胞菌感染后1、3、6、12及24小時，細胞上清液中檢測出IL一6，其濃度以時間依賴的方式增加(P<0.01)，分別為3.4士0.4Pg/ml、8.3士1.IPg/ml、12.6士l.3Pg/ml、23.2士3.3Pg/ml和35.3士5.7pg/ml(圖5)。一!料甲...12~._. 05CU5八曰勻工

本文編號：2728369