【摘要】：[背景]口腔鱗狀細胞癌（Oral squamous cell carcinomas，oscc）是頭頸部惡性腫瘤中發(fā)病率最高的惡性腫瘤，容易發(fā)生細胞侵襲和轉(zhuǎn)移導(dǎo)致患者預(yù)后較差。盡管口腔鱗狀細胞癌在臨床診斷、臨床治療各個環(huán)節(jié)不斷進步，但患者術(shù)后五年的存活率仍低于50%，這個數(shù)字在最近30年一直未得到有效的改變。研究表明，miRNA是腫瘤細胞發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，通過配對目標基因的蛋白質(zhì)編碼基因，誘導(dǎo)mRNA的降解或者翻譯的抑制，參與調(diào)控不同腫瘤細胞的進程。目前的研究發(fā)現(xiàn)， miRNA在口腔鱗狀細胞癌發(fā)生和發(fā)展中扮演關(guān)鍵角色，但對于其具體的作用和機制尚未清楚。 本課題應(yīng)用HiSeq deep sequencing(高通量深度測序)的方法，對口腔鱗癌組織和配對的癌旁組織樣本進行檢測，參照miRBase和Genebank數(shù)據(jù)庫，篩選口腔鱗癌中差異表達的miRNA和mRNA（差異表達miRNA的定義為：Fold-change1或者Fold-change-1，并且p-value0.01；差異表達mRNA的定義為：FDR≤0.001且倍數(shù)差異在2倍及以上的基因），構(gòu)建口腔鱗癌差異miRNA和mRNA表達譜，探討他們在口腔鱗癌發(fā)生發(fā)展中的表達變化規(guī)律；從表達水平上分析了差異miRNA和mRNA在口腔鱗癌中的相關(guān)關(guān)系；應(yīng)用Real-time PCR方法，檢測mir-20a-5p、ODZ3和TCHH在口腔鱗癌組織和癌旁組織中的表達情況，對測序數(shù)據(jù)的可靠性和準確性進行驗證。 [目的]我們應(yīng)用HiSeq deep sequencing(高通量深度測序)的方法，構(gòu)建miRNA和mRNA表達譜，篩選出差異性表達的miRNA和mRNA；初步分析miRNA和mRNA差異性表達在口腔鱗癌中的意義；并且對口腔鱗癌中差異性表達的miRNA/mRNA進行對接分析研究。為進一步研究miRNA在口腔鱗癌中的作用和機制提供理論和實驗依據(jù)。 [方法]選取10例手術(shù)切除新鮮凍存的口腔鱗癌及其配對的癌旁正常組織，Trizol法提取總RNA，應(yīng)用分光光度計測量RNA濃度；應(yīng)用高通量測序技術(shù)，構(gòu)建口腔鱗癌組織及其配對的癌旁正常組織miRNA/mRNA表達圖譜并分析；通過生物信息學(xué)技術(shù)預(yù)測miRNA的靶基因；口腔鱗癌組織和配對的癌旁組織顯著差異miRNA/mRNA表達譜的對接分析；應(yīng)用Real-Time PCR驗證差異表達的miRNA和mRNA在口腔鱗癌組織和癌旁組織中的表達情況。 [結(jié)果] （1）應(yīng)用HiSeq deep sequencing(高通量深度測序)的方法，分析了10對口腔鱗癌組織和配對的癌旁組織miRNA的表達情況，結(jié)合數(shù)據(jù)分析，我們對這些差異的miRNA在口腔鱗癌中的表達變化規(guī)律進行了總結(jié)分析，結(jié)果顯示：有77個miRNA顯著性差異表達，有24個miRNA表達下調(diào)，53個miRNA表達上調(diào)，提示這些miRNA與口腔鱗癌的發(fā)生密切相關(guān)。試驗中發(fā)現(xiàn)：口腔鱗癌組織和癌旁組織中有19個和14個新miRNA未在miRBase數(shù)據(jù)庫中注冊。 （2）應(yīng)用HiSeq deep sequencing(高通量深度測序)的方法，分析了10對口腔鱗癌組織和配對的癌旁組織mRNA的表達情況，結(jié)合數(shù)據(jù)分析，我們對這些差異的mRNA在口腔鱗癌中的表達變化規(guī)律進行了總結(jié)分析，結(jié)果顯示：在口腔鱗癌組織及其癌旁配對的正常組織中共發(fā)現(xiàn)14629個mRNA，其中，有1120個mRNA顯著性表達上調(diào)，有178個mRNA顯著性表達下調(diào)，提示這些mRNA的顯著差異性表達與口腔鱗癌的發(fā)生密切相關(guān)。 （3）通過對口腔鱗癌組織和配對的癌旁組織顯著差異miRNA/mRNA表達譜的對接分析，我們發(fā)現(xiàn)：不同的miRNA，其對接的靶基因數(shù)目不一樣，有可能為零，也有可能數(shù)量上千，例如：let-7c靶基因5301個；mir-17-5p靶基因6767個；mir-19a-3p靶基因7614個；mir-20a-5p靶基因為5865個，與之相反的是mir-184、mir-183-3p、mir-196a-5p等等靶基因確為零個；差異表達基因中對接的miRNA數(shù)目較多。受兩種以上的miRNA的調(diào)控，例如：MAGEA11受let-7a-3p、let-7b-3p、let-7d-3p、let-7f-1-3p、let-7f-2-3p、mir-15a-5p、mir-16a-5p等12個miRNA的調(diào)控；COL1OA1受mir-24-1-5p、mir-26a-5p、let-7a-3p、let-7b-3p、let-7d-3p等11個miRNA的調(diào)控；EMR1受mir-17-3p、mir-19-3p、mir-19a-3p、mir-20a-3p、mir-25-3p、mir-26b-3p6個miRNA的調(diào)控；與此類似的mRNA還有ODZ3、BAALC、 LRRC17等等。以上這些基因的表達異�？赡芘cmiRNA的密切調(diào)控有關(guān)。在口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展中，調(diào)控差異基因表達的miRNA不盡相同，他們的表達機制也不近相同，可能以某個miRNA為主，多種miRNA共同參與為輔。 （4）Real-Time PCR實驗表明，mir-20a-5p、ODZ3和TCHH表達情況與測序結(jié)果相符，可見，測序數(shù)據(jù)是可信的。 [結(jié)論]我們通過對同一批口腔鱗癌組織和配對的癌旁組織樣本中顯著差異的miRNA/mRNA動態(tài)表達譜的研究及對接分析，初步揭示了miRNA表達失調(diào)在口腔鱗癌中表達變化規(guī)律，進一步闡明了口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展的分子機制，為尋找有效的口腔鱗癌早期診斷及惡性進展的生物分子標志提供了充足的理論依據(jù)。
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號】：R739.8
【圖文】：

墾絎宦畚?16 圖 1：樣本提取總 RNA 之后實驗流程圖1.3.3 Illumina HiSeq 2000 系統(tǒng)進行 miRNA 測序并分析：1.3.3.1 基于 HiSeq 高通量測序技術(shù)的小 RNA 數(shù)字化分析，采用邊合成邊測序(SBS-sequencing by synthesis)，可減少因二級結(jié)構(gòu)造成的一段區(qū)域的缺失。并具有所需樣品量少，高通量，高精確性，擁有簡單易操作的自動化平臺和功能強大等特點，一次性獲得數(shù)百萬條小分子 RNA 序列，能夠快速全面地鑒定該物種在該狀態(tài)下的小分子 RNA 并發(fā)現(xiàn)新的小分子 RNA，構(gòu)建樣品之間的小分子RNA 差異表達譜，為小分子 RNA 功能研究提供有力工具。

南京醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文 1.3.3.2 信息分析流程（圖 2）：HiSeq 測序所得 50nt 序列，通過去接頭、去低質(zhì)量、去污染等過程完成數(shù)據(jù)處理得到 high quality tags，對其進行序列長度分布的統(tǒng)計及樣品間公共序列統(tǒng)計。將清理后的 high quality tags 分類注釋，可以獲得樣品中包含的各組分及表達量信息。將所有小 RNA 片段注釋后，用剩下的未注釋片段來進行：1. novel miRNA 的預(yù)測；2. 已知 miRNA 的堿基編輯預(yù)測。

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 潘翠霞;;口腔鱗癌患者中腫瘤標志物評估[J];國外醫(yī)學(xué).口腔醫(yī)學(xué)分冊;1993年06期

2 戴群，廖健興;口腔鱗癌術(shù)前應(yīng)用平陽霉素的近期療效觀察[J];實用癌癥雜志;1995年04期

3 田洪超;口腔鱗癌血清SOD活性的臨床研究[J];國外醫(yī)學(xué).口腔醫(yī)學(xué)分冊;1998年03期

4 姚華,吳葆萱,吳求亮;EGFR在口腔粘膜鱗癌和癌前病變中的表達及意義[J];口腔醫(yī)學(xué);1999年01期

5 楊曉笛,袁祥民,沈望珍;口腔鱗癌3p24等位基因雜合缺失的研究[J];新疆醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;1999年01期

6 張書平,丁繼芬;唾液中唾液酸、癌胚抗原測定在口腔鱗癌診斷中的意義[J];口腔醫(yī)學(xué);2003年05期

7 李衛(wèi)星 ,張朝霞 ,張秀清 ,劉宣;口腔鱗癌端粒酶活性的檢測及臨床意義[J];現(xiàn)代口腔醫(yī)學(xué)雜志;2003年01期

8 莊廣鵬;VM方案化療在口腔鱗癌綜合治療中應(yīng)用及療效評價[J];中國民康醫(yī)學(xué);2004年02期

9 高子彬,段玉芹,許彥枝,陳彥平,郭蘭濤;基質(zhì)金屬蛋白酶2及其抑制劑在口腔鱗癌中的表達[J];中華口腔醫(yī)學(xué)雜志;2004年03期

10 姚麗艷,張白凌;PCNA在口腔鱗癌中的表達及其臨床意義[J];福建醫(yī)藥雜志;2005年01期

相關(guān)會議論文 前10條

1 陳黎;李寧;;miRNA在豬卵母細胞成熟過程中作用[A];“基因、進化與生理功能多樣性”海內(nèi)外學(xué)術(shù)研討會暨中國生理學(xué)會第七屆比較生理學(xué)學(xué)術(shù)會議論文摘要[C];2009年

2 王星果;郁建鋒;龔道清;顧志良;;雞脂肪組織和骨骼肌miRNA的篩選和表達研究[A];第十二次全國畜禽遺傳標記研討會論文集[C];2010年

3 成海蘭;姜孝成;;miRNA與水稻種子活力的相關(guān)性研究[A];第二屆全國種子科學(xué)與技術(shù)學(xué)術(shù)研討會論文摘要集[C];2011年

4 楊子學(xué);陳寶安;;miRNA在淋巴造血和急性淋巴細胞白血病中的作用[A];第13屆全國實驗血液學(xué)會議論文摘要[C];2011年

5 付彥;吳徐行;楊德英;謝躍;古小彬;王淑賢;楊光友;;犬惡絲蟲成蟲miRNA的研究[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會家畜寄生蟲學(xué)分會第六次代表大會暨第十一次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2011年

6 李霞;;MiRNA-miRNA Synergistic and Subpathway Network[A];第四屆全國生物信息學(xué)與系統(tǒng)生物學(xué)學(xué)術(shù)大會論文集[C];2010年

7 何卓晶;洪艷;;病毒miRNA研究進展概述[A];2011年浙江省醫(yī)學(xué)會醫(yī)學(xué)病毒學(xué)分會、醫(yī)學(xué)微生物與免疫學(xué)分會學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2011年

8 鄒豐;劉麗江;;miRNA在腫瘤轉(zhuǎn)移中的研究進展[A];第九屆全國腫瘤轉(zhuǎn)移學(xué)術(shù)大會暨2011年黑龍江省醫(yī)學(xué)會腫瘤學(xué)年會摘要集[C];2011年

9 王旭霞;趙作勤;薛立偉;;腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因在口腔鱗癌中的表達及其臨床意義[A];第八次全國口腔頜面—頭頸腫瘤會議論文匯編[C];2009年

10 齊偉;毛弛;;原發(fā)口腔鱗癌頸ⅡB區(qū)轉(zhuǎn)移的初步研究[A];第八次全國口腔頜面—頭頸腫瘤會議論文匯編[C];2009年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 何增壽;口腔鱗癌化療可首選VM－26[N];中國醫(yī)藥報;2003年

2 仇 逸 祖 亮;研究證實：病毒感染可導(dǎo)致口腔鱗癌[N];中國高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)導(dǎo)報;2001年

3 記者 張曄;細胞中“宅男宅女”是傳遞“信號”大使[N];科技日報;2010年

4 實習(xí)生 蔣洪濤　王昊魁;miRNA—21：讓腫瘤對它“上癮”[N];科技日報;2010年

5 仇逸 陳祖亮;砒霜能抑制口腔鱗癌[N];江蘇科技報;2002年

6 記者 許琦敏;“全球特工”高效調(diào)控生命活動[N];文匯報;2010年

7 ;生物芯片 臨床應(yīng)用漸入佳境[N];健康報;2010年

8 蔣立明;建立研發(fā)基地 開發(fā)高新技術(shù)[N];紹興日報;2009年

9 衣曉峰　陳英云;微小核苷酸：揭開心律失常和心源性猝死之謎[N];中國醫(yī)藥報;2010年

10 記者 常麗君;驗血可比CT掃描提前28個月發(fā)現(xiàn)肺癌[N];科技日報;2011年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 張忱;大鼠癲癇持續(xù)狀態(tài)后海馬miRNA表達譜的研究[D];中南大學(xué);2010年

2 盧韶華;肺癌患者組織及血漿miRNA腫瘤標記物的發(fā)現(xiàn)及驗證[D];復(fù)旦大學(xué);2010年

3 何艷;肝細胞肝癌相關(guān)基因中miRNA結(jié)合靶點內(nèi)多態(tài)的篩選及功能分析[D];蘇州大學(xué);2010年

4 李帥;miRNA-101和miRNA-122功能研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2010年

5 夏偉;臨床腫瘤標本中差異miRNA的檢測及mir-200b功能研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2010年

6 劉偉;SAMP8小鼠海馬異常表達miRNA的鑒定和初步功能研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2009年

7 羅紅春;胃癌miRNA表達譜及胃癌中顯著下調(diào)的miR-9和miR-433的功能研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2010年

8 茅凌翔;腸道病毒71型分子流行病學(xué)調(diào)查及miRNA抑制腸道病毒71型體外復(fù)制的研究[D];江蘇大學(xué);2011年

9 張文輝;胃遠端腺癌miRNA表達譜及miR-204調(diào)控機制的初步研究[D];中國人民解放軍軍醫(yī)進修學(xué)院;2010年

10 陰祖軍;脅迫誘導(dǎo)棉花microRNA的差異表達分析[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2011年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 趙百慧;油松胚珠游離核分裂期miRNA的克隆與初步鑒定[D];北京林業(yè)大學(xué);2010年

2 張坤山;調(diào)控過氧化物酶體生物合成與增殖的miRNA分析與鑒定[D];南昌大學(xué);2010年

3 黎媚媚;內(nèi)含子27堿基miRNA對內(nèi)皮一氧化氮合酶調(diào)控機制的研究[D];南華大學(xué);2010年

4 尤昊;抑制miRNA-21的表達對膽管癌細胞增殖、凋亡、侵襲的影響及其靶基因的探討[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2011年

5 楊文征;馬鈴薯保守性miRNAs的預(yù)測與驗證[D];浙江理工大學(xué);2010年

6 鄭培明;白紋伊蚊miRNA的測序、鑒定及表達譜的初步分析[D];南方醫(yī)科大學(xué);2010年

7 黃寶春;內(nèi)含子miRNA反饋調(diào)節(jié)其宿主基因表達和功能的研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2010年

8 羅榮;DmiR：小RNA轉(zhuǎn)錄組深度測序的miRNA預(yù)測[D];福建農(nóng)林大學(xué);2011年

9 薄維平;木薯耐寒相關(guān)microRNA的差異表達分析[D];海南大學(xué);2010年

10 周鵬方;豬和甲型流感病毒microRNA預(yù)測軟件系統(tǒng)[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2010年

本文編號：2720653