【摘要】：[目的] 克隆表達(dá)牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonas gingivalis, P.g)牙齦素中粘附素區(qū)域的Hgp44基因,并純化目的蛋白。觀察Hgp44基因作用于人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞后對(duì)其產(chǎn)生IL-6,IL-8的影響。 [方法] 通過PCR和基因重組技術(shù),克隆得到P.g ATCC33277的Hgp44基因,插入到克隆載體pMD18-T中并測(cè)序鑒定。經(jīng)過酶切后將目的基因片段與表達(dá)載體pET22b相連,構(gòu)建出表達(dá)質(zhì)粒pET22b-Hgp44。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)中,用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白,通過SDS-PAGE, Western blot進(jìn)行分析。用固定化金屬親和層析法(IMAC)對(duì)重組蛋白進(jìn)行分離純化,從而獲得目的蛋白Hgp44。 培養(yǎng)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞,用不同濃度的Hgp44蛋白分別作用于HUVECs,用ELISA試劑盒檢測(cè)IL-6, IL-8的表達(dá)變化。 [結(jié)果] 成功培養(yǎng)牙齦卟啉單胞菌ATCC33277菌株,并克隆得到目的基因片段,約為1100bp,與預(yù)期大小相符,測(cè)序結(jié)果與GenBank中ATCC33277國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)菌株的RgpA的等位基因序列U15282一致。IPTG誘導(dǎo)后的菌體經(jīng)SDS-PAGE后形成一個(gè)以包涵體形式存在的44KD的融合蛋白。Western blot檢測(cè)證實(shí)其具有免疫原性。用Ni-NTA柱純化后復(fù)性得到了目的蛋白Hgp44。最后得到終濃度約3.5mg/L的目的蛋白Hgp44。 ELISA檢測(cè)分析得到,Hgp44能促進(jìn)HUVECs分泌IL-6和IL-8,從而引起初始的炎癥反應(yīng)。 [結(jié)論] 成功克隆表達(dá)了牙齦卟啉單胞菌Hgp44基因,并純化出了目的蛋白。明確了目的蛋白對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生IL-6, IL-8的影響,為進(jìn)一步闡明Hgp44和人內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用關(guān)系及明確牙齦卟啉單胞菌與心血管疾病之間的關(guān)系奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R780.2

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本文編號(hào)：2718531