【摘要】： 應(yīng)力作用下軟骨細(xì)胞代謝和功能的改變是導(dǎo)致軟骨組織不斷生長改建的主要原因。在正常人體關(guān)節(jié)軟骨所受到的各種力中,壓力是最主要的,研究表明,軟骨受到動(dòng)態(tài)和靜態(tài)壓縮載荷影響了軟骨移植物的生物合成。但到目前為止,有關(guān)動(dòng)態(tài)壓力作用下調(diào)控軟骨細(xì)胞生物學(xué)行為變化的分子機(jī)制尚不清楚,通過差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究可以識(shí)別參與細(xì)胞生命活動(dòng)過程中的重要蛋白質(zhì),為深入探索其機(jī)制提供信息。本研究力圖構(gòu)建類似于體內(nèi)軟骨組織的體外軟骨細(xì)胞立體培養(yǎng)動(dòng)態(tài)壓力加載模型,并借助于蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù),尋找和發(fā)現(xiàn)動(dòng)態(tài)壓力作用下調(diào)控軟骨細(xì)胞代謝和功能改變的特定的蛋白質(zhì)分子,為動(dòng)態(tài)壓力作用下軟骨改建機(jī)理的更深入研究提供依據(jù)。 研究方法:1)取4W齡乳兔膝關(guān)節(jié)軟骨組織,體外分離、培養(yǎng)軟骨細(xì)胞、對培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞進(jìn)行蕃紅“O”、甲苯胺藍(lán)及II型膠原免疫組化染色等表型鑒定;2)將鑒定具有正常表型的P1代軟骨細(xì)胞和海藻酸鹽復(fù)合,形成凝膠小球培養(yǎng),觀察藻酸鈣凝膠內(nèi)軟骨細(xì)胞生長情況。通過MTT檢測確定細(xì)胞活性,使用二甲基亞甲蘭法測定樣品硫酸化糖胺多糖(GAG)的含量,同時(shí)對在藻酸鈣凝膠內(nèi)的軟骨細(xì)胞進(jìn)行組織學(xué)及組織化學(xué)染色以鑒定其表型;3)選取濃度分別為1%、2%、3%海藻酸鹽,并通過INSTRON3365測定三種濃度海藻酸鹽形成凝膠的機(jī)械剛度,將P1代軟骨細(xì)胞分別與這三種濃度的海藻酸鈣復(fù)合,培養(yǎng)28天,通過MTT法,二甲基亞甲蘭法及RT-PCR測定并比較三種條件下軟骨細(xì)胞增殖狀況,GAG含量變化及II型膠原,聚集蛋白聚糖,I型膠原的基因表達(dá)狀況從而篩選出最有利于軟骨細(xì)胞生長的3D海藻酸鹽凝膠培養(yǎng)環(huán)境;4)仿照Shram系統(tǒng)構(gòu)建了體外立體培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞動(dòng)態(tài)壓力加載模型;并參照Shram等壓力加載條件給予0.2MPa,0.66Hz靜水壓持續(xù)作用4h,提取培養(yǎng)相同時(shí)間的加壓組和未加壓組藻酸鈣凝膠中的軟骨細(xì)胞總蛋白,進(jìn)行雙向電泳分離,電泳后的凝膠銀染,用分析軟件對圖譜進(jìn)行分析,從而建立動(dòng)態(tài)壓力作用下藻酸鹽立體培養(yǎng)條件下兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞差異表達(dá)蛋白質(zhì)圖譜;5)使用基質(zhì)輔助激光解析離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)對得到的肽段進(jìn)行分析,并結(jié)合蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫,鑒定出差異表達(dá)的蛋白點(diǎn)。 結(jié)果:采用消化法進(jìn)行幼兔膝關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞原代培養(yǎng),經(jīng)甲苯胺蘭,II型膠原染色鑒定陽性,所培養(yǎng)細(xì)胞生長狀態(tài)良好其軟骨細(xì)胞表形能夠保持3代穩(wěn)定,且反映其生長增殖能力的生長曲線正常,在體外培養(yǎng)時(shí)可經(jīng)歷與在體狀況相似的成熟過程,并具有與在體的關(guān)節(jié)軟骨相似的生物學(xué)活性。2)在海藻酸鈣小球內(nèi)培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞能夠保持球形狀態(tài),且隨時(shí)間的延長,細(xì)胞逐漸增殖,GAG含量增多。經(jīng)蕃紅“O”、甲苯胺藍(lán)及II型膠原免疫組化染色均為陽性。鑒定證實(shí)為具有正常表型的軟骨細(xì)胞。3)濃度對海藻酸鈣凝膠的機(jī)械剛度具有顯著的影響。1%的海藻酸鈣凝膠的壓縮模量為19.44±2.72顯著低于2%(167.09±12.43)和3%(226.24±19.82)。在培養(yǎng)的21天,軟骨細(xì)胞在較軟凝膠內(nèi)增殖較快,但在21天后,在最軟的凝膠內(nèi)細(xì)胞增殖顯著減少;基質(zhì)積累隨海藻酸鹽剛度改變而不同。在培養(yǎng)第四周,軟骨細(xì)胞在中間剛度組表現(xiàn)出最高的GAG合成,而軟骨特征性基因CoLII、Agg的表達(dá)在具有中等剛度的凝膠內(nèi)最穩(wěn)定;4)通過雙向電泳技術(shù)我們建立了動(dòng)態(tài)壓力作用下立體培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞差異表達(dá)蛋白質(zhì)圖譜。未加壓組檢測到1632±54個(gè)蛋白點(diǎn),加壓組檢測到1698±13個(gè)蛋白點(diǎn)。通過軟件分析,找到了10個(gè)差異蛋白點(diǎn),其中2個(gè)在加壓培養(yǎng)后表達(dá)消失;2個(gè)在加壓培養(yǎng)后出現(xiàn)表達(dá);6個(gè)表達(dá)增強(qiáng)。5)將這10個(gè)蛋白點(diǎn)通過質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)分析,獲得相應(yīng)的肽質(zhì)量指紋圖譜,進(jìn)一步通過蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫鑒定了8個(gè)蛋白點(diǎn),其中有意義的蛋白點(diǎn)6個(gè)。它們分別是:prolyl 4-hydroxylase alpha I,pyruvate kinase,L-lactate dehydrogenase A,Prolyl 4-hydroxylase subunit beta,destrin isoform,alpha enolase。 結(jié)論:1)采用酶消化法獲得幼兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的方法簡便可行。體外培養(yǎng)的原代或P1,P2代軟骨細(xì)胞具有良好的軟骨細(xì)胞表型特征,適用于實(shí)驗(yàn)研究。2)軟骨細(xì)胞在藻酸鈣凝膠小球中生長維持了球狀形態(tài),細(xì)胞少量增殖并合成GAG,II型膠原,說明海藻酸鈣凝膠適合于軟骨細(xì)胞的生長。3)具有中等剛度的海藻酸鈣凝膠更有利于軟骨細(xì)胞的生長和軟骨表型的維持。4)利用差異蛋白質(zhì)組學(xué)方法研究動(dòng)態(tài)壓力作用對立體培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞的影響是可行的;5)通過差異蛋白質(zhì)組學(xué)研究我們發(fā)現(xiàn)了動(dòng)態(tài)壓力作用下調(diào)控軟骨細(xì)胞生物學(xué)行為的6個(gè)有意義的關(guān)鍵蛋白質(zhì),并推測了其在軟骨改建中的作用。為今后研究這些差異蛋白在軟骨細(xì)胞受壓力刺激后代謝和功能變化的生物學(xué)作用奠定了基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2009
【分類號(hào)】：R78;R684
【圖文】：

圖 1 海藻酸鈣凝膠的“蛋格”結(jié)構(gòu)海藻酸鈣水凝膠具有高孔隙率，平均孔隙直徑在 5-200 nm，允許小分子如葡萄糖和氧擴(kuò)散.其孔徑和降解率可通過調(diào)節(jié)溶液的濃度和類型及交聯(lián)濃度來改變[35,36].凝膠為微囊化細(xì)胞提供暫時(shí)性基質(zhì)支持并允許細(xì)胞以較慢的遷移速度通過粘稠的凝膠并黏附到支架的孔隙壁上為營養(yǎng)和廢物交換提供半擴(kuò)散環(huán)境.在 Na+富裕的環(huán)境中，凝膠的 Ca2+被代替，凝膠結(jié)構(gòu)隨時(shí)間瓦解[37,38]，從而開放更多的擴(kuò)散通道使軟骨細(xì)胞擴(kuò)增并形成細(xì)胞外基質(zhì)。藻酸鹽水凝膠在軟骨細(xì)胞培養(yǎng)中的應(yīng)用軟骨細(xì)胞是軟骨組織的細(xì)胞成分，他們分泌軟骨組織特有的基質(zhì)，這些基質(zhì)主要包括 II、IX、XI[39]和 X[40]型膠原，以及聚糖蛋白[41]。但是當(dāng)軟骨細(xì)胞單層培養(yǎng)，容易去分化表現(xiàn)出成纖維細(xì)胞的表型，分泌 I、III 和 V型膠原，II 型膠原和蛋白聚糖分泌減少[42]。海藻酸鹽凝膠具有親水的本質(zhì)

易受外界因素影響而發(fā)生改變。隨著時(shí)間延長，貼壁細(xì)胞逐漸增多，細(xì)胞密度逐漸增大，細(xì)胞主要為多角形或鵝卵石樣，細(xì)胞折光性好，立體感強(qiáng)，呈不規(guī)則立體“鋪路石”樣（圖1-1A）。以同樣密度接種的傳代細(xì)胞貼壁時(shí)間短,約10h左右.貼壁后細(xì)胞生長旺盛,一般3-5天即可長滿皿底. 原代、P1代、P2代細(xì)胞生長良好，增殖，分化及分泌基質(zhì)的能力強(qiáng)。但到P3代以后，軟骨細(xì)胞形態(tài)逐漸發(fā)生改變，細(xì)胞伸長變大，呈長梭形，類似于

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本文編號(hào)：2717678