【摘要】：一、外源性FGF8蛋白可以在體外挽救無牙區(qū)牙胚發(fā)育 研究目的：小鼠牙列在牙胚的退化過程中形成了一個(gè)不長(zhǎng)牙的無牙區(qū),這是小鼠牙列的一個(gè)特征。無牙區(qū)牙胚的再生為研究牙的的再生和替換提供了一個(gè)極佳的模型,以前有研究發(fā)現(xiàn),無牙區(qū)FGF信號(hào)被抑制是無牙區(qū)牙胚退化的一個(gè)原因。本研究中,在小鼠胚胎無牙區(qū)加入外源性FGF蛋白,觀察外源性FGF蛋白對(duì)無牙區(qū)發(fā)育的影響,進(jìn)一步確認(rèn)FGF是否可以挽救無牙區(qū)牙胚的發(fā)育。 研究方法：①將CD-1小鼠交配后,查到母鼠孕栓當(dāng)天中午記為E0.5,E13.5時(shí)收集胚胎,顯微鏡下將下頜同個(gè)象限中的切牙胚,無牙區(qū)和磨牙胚分離出來。將浸泡過生長(zhǎng)因子液體的藍(lán)色瓊脂小珠加到無牙區(qū)牙胚上。將同時(shí)分離的切牙胚、磨牙胚和加了生長(zhǎng)因子小珠的無牙區(qū)牙胚體外培養(yǎng)24h后,移植至CD1小鼠腎囊膜下培養(yǎng)4w后,分離移植塊中的牙組織。②分離E13.5小鼠胚胎半個(gè)下頜,將浸有生長(zhǎng)因子的瓊脂小珠從無牙區(qū)插到間充質(zhì)中,浸泡BSA的小珠做為對(duì)照。腎囊膜下培養(yǎng)4w后分離牙組織。③將浸泡過生長(zhǎng)因子液體的藍(lán)色瓊脂小珠加到分離的無牙區(qū)牙胚上,浸泡過BSA的小珠做為對(duì)照。置于半固體培養(yǎng)基上體外培養(yǎng)24h或48h后,分別用作組織學(xué)分析,原位雜交分析,BrdU標(biāo)記和TUNEL分析。 研究結(jié)果：FGF8可以誘導(dǎo)E13.5的無牙區(qū)牙胚體外成牙。但是并不能在一個(gè)下頜象限中挽救無牙區(qū)牙胚的發(fā)育。FGF8通過促進(jìn)細(xì)胞增殖和抑制細(xì)胞凋亡而阻止了無牙區(qū)牙胚的退化。原位雜交結(jié)果顯示,FGF8誘導(dǎo)了一些成牙相關(guān)基因在無牙區(qū)牙胚的表達(dá),從而啟動(dòng)了無牙區(qū)牙胚的發(fā)育程序。 結(jié)論：FGF8可以促進(jìn)無牙區(qū)細(xì)胞增殖并且抑制無牙區(qū)牙胚上皮細(xì)胞凋亡,FGF8還可以誘導(dǎo)多種對(duì)牙發(fā)育非常關(guān)鍵的基因在無牙區(qū)牙胚表達(dá),由此重新啟動(dòng)無牙區(qū)牙胚的發(fā)育程序。我們的結(jié)果還證明了無牙區(qū)周圍的牙胚通過多種信號(hào)途徑抑制了無牙區(qū)牙胚的發(fā)育。 二、BMP信號(hào)通路在牙和腭發(fā)育中的作用 研究目的：骨形成蛋白家族(BMPs)屬于TGF-β超家族,它們包括超過20種多功能的細(xì)胞因子。BMP信號(hào)路徑在顱頜面部器官發(fā)育中起著關(guān)鍵作用,包括牙和腭部發(fā)育。BmprⅠa和BmprⅠb編碼的兩種I型BMP受體是BMP信號(hào)路徑轉(zhuǎn)導(dǎo)的主要受體,以前的研究發(fā)現(xiàn),在上皮中表達(dá)的BmprⅠa對(duì)牙和腭突發(fā)育起著重要作用,但是間充質(zhì)中BmprⅠa的作用仍不清楚。在本研究中,我們研究了牙及腭突發(fā)育的過程中,在間充質(zhì)中表達(dá)的BmprⅠa的作用;并檢測(cè)了小鼠腭部和牙發(fā)育過程中,BmprⅠa和BmprⅠb是否有功能互補(bǔ)。 研究方法：①將Wnt1Cre; BmprⅠa+/-小鼠與BmprⅠaF/F小鼠交配就可以得到Wnt1Cre; BmprⅠaF/-,即在神經(jīng)嵴來源的細(xì)胞中特異的失活BmprⅠa的小鼠。為了阻止胚胎期小鼠早死,將終濃度為200μg/ml的異丙腎上腺素加到2.5mg/ml的維生素C溶液中,從胚胎E7.5開始給孕鼠喂藥。小鼠胎齡計(jì)算時(shí)以查到孕栓的當(dāng)天中午計(jì)為胚胎E0.5天,按胎齡獲得的胚胎先用冷的PBS沖洗數(shù)遍,分離小鼠胚胎頭部,4%的多聚甲醛在4℃過夜固定,經(jīng)過脫水,透明,石蠟包埋,10μm切片用來進(jìn)行組織學(xué)染色分析和原位雜交實(shí)驗(yàn)。另外有一部分標(biāo)本經(jīng)過不同的處理后準(zhǔn)備用來做冰凍切片進(jìn)行免疫組化分析。②為了得到同時(shí)含有Wnt1Cre;BmprⅠaF/-和pMes-caBmprⅠb兩個(gè)位點(diǎn)的小鼠,將Wnt1Cre;BmprⅠa+/-小鼠與BmprIaF/+;pMes-caBmprⅠb小鼠交配,含有這些復(fù)合位點(diǎn)的小鼠的基因型則為Wnt1Cre;BmprⅠaF/-;caⅠb。如上所述,給孕鼠喂藥,收集胚胎進(jìn)行組織學(xué)分析。③為了確定Wnt1Cre;BmprⅠaF/-;caIb小鼠的牙發(fā)育是否延遲,將E13.5的Wnt1Cre;BmprⅠaF/-:caIb和野生型小鼠胚胎下頜磨牙牙胚分離出來后進(jìn)行腎囊膜移植。本實(shí)驗(yàn)使用成熟的CD1雄鼠進(jìn)行腎囊膜移植和培養(yǎng)。 研究結(jié)果：BmprⅠa和BmprⅠb在發(fā)育的牙和腭部的表達(dá)區(qū)域有重疊但又明顯不同。特異性失活神經(jīng)嵴來源的間充質(zhì)細(xì)胞中的BmprⅠa會(huì)導(dǎo)致一種并不常見的腭裂—繼發(fā)腭前部裂。這種突變型小鼠的牙發(fā)育停滯在蕾狀期或帽狀早期,并且伴有嚴(yán)重的下頜缺陷。牙及腭部的缺陷與其間充質(zhì)中BMP應(yīng)答基因下調(diào)及細(xì)胞增殖的降低相關(guān)。為了確定在牙和腭部的發(fā)育過程中BmprⅠb是否可以代替BmprⅠa的作用,在神經(jīng)嵴來源間充質(zhì)中特異性失活BmprⅠa的同時(shí)持續(xù)的過表達(dá)激活的BmprⅠb,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在間充質(zhì)中用caBmprⅠb代替BmprⅠa可以挽救磨牙及上頜切牙的缺陷,但是被挽救的牙表現(xiàn)出成牙本質(zhì)細(xì)胞和成釉細(xì)胞分化的延遲。相反,caBmprⅠb并不能挽救腭裂及下頜缺陷,包括下切牙的缺失。 結(jié)論：正常的腭突和牙發(fā)育絕對(duì)需要正常表達(dá)的BmprⅠa,在顱頜面部發(fā)育的過程中,BmprⅠb以組織特異性的方式與BmprⅠa有局限性的功能互補(bǔ)。 三、BMP信號(hào)平衡在牙和腭發(fā)育中的作用 研究目的：在實(shí)驗(yàn)二中我們用Wnt1Cre特異性地失活神經(jīng)嵴來源的間充質(zhì)細(xì)胞中的BmprⅠa,會(huì)導(dǎo)致一種并不常見的腭裂—繼發(fā)腭前部裂,這種突變小鼠的牙發(fā)育停滯在蕾狀期或帽狀早期,并且伴有嚴(yán)重的下頜缺陷。并且發(fā)現(xiàn)在間充質(zhì)中用caBmprⅠb代替BmprⅠa可以部分挽救磨牙及上頜切牙的缺陷,但是caBmprⅠb并不能挽救腭裂及下頜缺陷包括下切牙的缺失。在用caBmprⅠb挽救突變型小鼠的牙及腭部缺陷的同時(shí),我們也用caBmprⅠa作為陽性的平行對(duì)照,利用轉(zhuǎn)基因小鼠模型研究了BMP信號(hào)平衡對(duì)小鼠顱頜面部發(fā)育的影響。 研究方法：①將Wnt1Cre;BmprⅠa+/-小鼠與BmprⅠaF/+;pMes-caBmprⅠa小鼠交配得到基因型分別為Wnt1Cre; BmprⅠaF/-, Wnt1Cre; BmprⅠaF/-; pMes-caBmprⅠa, Wnt1Cre; BmprⅠaF/+; pMes-caBmprⅠa和Wnt1Cre; pMes-caBmprⅠa。將終濃度為200μg/m(?)的異丙腎上腺素加到2.5mg/ml的維生素C溶液中,從胚胎E7.5開始給孕鼠喂藥,以阻止胚胎死亡的發(fā)生。②小鼠胎齡計(jì)算時(shí)以查到孕栓的當(dāng)天中午計(jì)為胚胎E0.5天,按胎齡獲得Wnt1Cre; pMes-caBmprⅠa小鼠不同時(shí)期胚胎。胚胎用冷的PBS沖洗數(shù)遍,分離小鼠胚胎頭部,4%的多聚甲醛在4℃過夜固定,經(jīng)過脫水,透明,石蠟包埋,10μm切片用來進(jìn)行組織學(xué)染色分析和原位雜交實(shí)驗(yàn)。另一部分標(biāo)本經(jīng)過不同的處理后準(zhǔn)備用來做冰凍切片進(jìn)行免疫組化分析。③為了確定Wnt1Cre; pMes-caBmprⅠa小鼠的牙發(fā)育是否延遲,將E13.5的Wnt1Cre; pMes-caBmprⅠa和野生型小鼠胚胎下頜磨牙牙胚分離后進(jìn)行腎囊膜移植。本實(shí)驗(yàn),使用成熟的CD1雄鼠進(jìn)行腎囊膜移植和培養(yǎng)。 研究結(jié)果：①隨著間充質(zhì)中BmprⅠa量的變化小鼠顱頜面部畸形的不同。②Wnt1Cre介導(dǎo)的BmprⅠa在間充質(zhì)中的過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致繼發(fā)腭完全性的腭裂和牙分化的延遲,同時(shí)伴有腭突前部間充質(zhì)細(xì)胞增殖缺陷和腭突后部異位軟骨的形成。 結(jié)論：正常的腭突和牙發(fā)育需要平衡的BMP信號(hào)活性,間充質(zhì)中過度的BMP信號(hào)通路活性會(huì)造成腭突前部細(xì)胞增殖水平的降低和后部異位軟骨的形成而導(dǎo)致腭裂,并且延遲成牙本質(zhì)細(xì)胞和成釉細(xì)胞分化。
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2011
【分類號(hào)】：R780.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2712736