【摘要】：口腔癌是嚴(yán)重危害人類健康的惡性疾患,對(duì)口腔癌治療的長期探索提示放射治療是口腔癌最有效的治療方法之一。但是,口腔癌患者接受放射治療后常發(fā)生放射性口炎,目前應(yīng)用的多種治療方法均難以達(dá)到滿意的治療效果,這嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量,并干擾了患者的系統(tǒng)治療。因此,促進(jìn)口腔黏膜上皮細(xì)胞增殖遷移,修復(fù)缺損的口腔黏膜,是防治放射性口炎的關(guān)鍵,也是目前腫瘤支持治療的研究熱點(diǎn)。 角化細(xì)胞生長因子(Keratinocyte growth factor, KGF)是一種上皮細(xì)胞特異性的生長因子,是目前已知的與上皮細(xì)胞創(chuàng)傷愈合密切相關(guān)的細(xì)胞因子,能夠與上皮細(xì)胞上的特異性受體相結(jié)合,在上皮損傷修復(fù)過程中大量表達(dá),并具有促進(jìn)上皮細(xì)胞增殖和遷移的作用,可促進(jìn)上皮細(xì)胞從傷口邊緣移行到基質(zhì),加速再上皮化。有研究表明KGF有助于修復(fù)放射性口炎。KGF能夠抑制口腔黏膜上皮細(xì)胞凋亡和DNA損傷,并促進(jìn)口腔黏膜上皮細(xì)胞增殖和遷移,從而保護(hù)口腔黏膜組織,促進(jìn)其再生�？谇痪植繎�(yīng)用KGF噴霧劑或注射KGF,能夠顯著促進(jìn)口腔黏膜細(xì)胞增殖和遷移,增強(qiáng)其活性,促進(jìn)口腔黏膜炎明顯好轉(zhuǎn)。但是很多研究證實(shí)KGF與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。KGF因?yàn)槠浯倌[瘤生長的潛在風(fēng)險(xiǎn),被禁止用于治療實(shí)體瘤患者發(fā)生的口腔黏膜炎。而且目前應(yīng)用的KGF產(chǎn)品生物半衰期短,穩(wěn)定性差,易降解失活。這些因素限制了KGF的廣泛應(yīng)用。 噬菌體隨機(jī)肽庫涵蓋性好,己廣泛用于抗原表位的模擬和蛋白質(zhì)工程的改造等方面,特別是小分子活性肽的展示,可用于研制新型創(chuàng)面藥物和生長因子受體激動(dòng)劑。利用該技術(shù)己成功篩選獲得多種生長因子的模擬肽,例如：FGF, CTGF和VEGF等。利用噬菌體篩選技術(shù)篩選獲得多種可編碼生物活性KGF的關(guān)鍵基因片段,應(yīng)用噬菌體展示技術(shù),構(gòu)建展示KGF噬菌體活性肽。與天然蛋白相比,合成肽具有分子量小、作用單一、穩(wěn)定性好、免疫原性低、可溶性好和可大量生產(chǎn)等多種優(yōu)點(diǎn)。因此,利用噬菌體隨機(jī)肽庫篩選技術(shù)篩選KGF的關(guān)鍵基因,繼而采用噬菌體構(gòu)建和展示技術(shù),構(gòu)建展示制備KGF噬菌體活性肽,有望增強(qiáng)其天然蛋白的促上皮細(xì)胞增殖、遷移的作用,同時(shí)增加穩(wěn)定性,降低致瘤性等副作用,為局部治療防治放射性口炎提供新型藥物。 本研究為提高KGF的活性、應(yīng)用效率和應(yīng)用安全性,為人類口腔癌放射治療后的放射性口炎的防治提供一種新型藥物,有助于改善腫瘤患者的生活質(zhì)量,有助于患者接受正規(guī)的治療,為最終治愈腫瘤提供較好的輔助性治療。 第一部分KGF噬菌體模擬肽篩選及離體實(shí)驗(yàn) 目的以KGF的單克隆抗體為靶,應(yīng)用噬菌體隨機(jī)7肽庫生物淘選具有刺激人口腔黏膜上皮細(xì)胞增殖作用的KGF噬菌體模擬肽,分析KGF的序列結(jié)構(gòu)。 方法以KGF的單克隆抗體為靶,進(jìn)行4輪生物淘選噬菌體隨機(jī)7肽庫富集包含KGF特異性模擬肽的噬菌體,對(duì)隨機(jī)挑選的噬菌體克隆進(jìn)行擴(kuò)增,并進(jìn)行ELISA檢測,選擇ELISA結(jié)果較好的單克隆噬菌體,提取DNA進(jìn)行測序和序列分析,并分析序列的相擬性；應(yīng)用MTT方法檢測KGF噬菌體模擬肽促進(jìn)人口腔黏膜上皮細(xì)胞增殖的作用；用免疫熒光法鑒定KGF噬菌體活性肽與人口腔黏膜上皮細(xì)胞的細(xì)胞親和力；用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測KGFR,人防御素β3, c-Fos和c-Jun的表達(dá)情況。 結(jié)果經(jīng)過4輪生物淘選,富集了特異性噬菌體。ELISA結(jié)果顯示部分噬菌體包含KGF特異性的模擬肽。測序發(fā)現(xiàn)兩種KGF噬菌體模擬肽,MTT結(jié)果顯示這兩種KGF噬菌體模擬肽能夠促進(jìn)人口腔黏膜上皮細(xì)胞增殖。免疫熒光鑒定結(jié)果顯示這兩種KGF噬菌體模擬肽具有較好的細(xì)胞親和力。RT-PCR結(jié)果顯示KGF和兩種KGF噬菌體模擬肽能夠促進(jìn)KGFR的表達(dá)。人防御素β3在KGF對(duì)照組和兩種KGF噬菌體模擬肽組中高表達(dá),c-Fos和c-Jun在KGF對(duì)照組中高表達(dá),而在兩種KGF噬菌體模擬肽組中表達(dá)不增加,或表達(dá)較弱。 結(jié)論從噬菌體隨機(jī)7肽庫中生物淘選到了兩種KGF噬菌體模擬肽,能夠顯著促進(jìn)人口腔黏膜上皮細(xì)胞增殖；這兩種KGF噬菌體模擬肽能夠促進(jìn)KGFR的表達(dá),可能是一種正反饋反應(yīng)；這兩種KGF噬菌體模擬肽能夠促進(jìn)人防御性β3的表達(dá),可能有助于控制潰瘍創(chuàng)面的感染,有助于創(chuàng)面早日封閉；這兩種KGF噬菌體模擬肽不會(huì)促進(jìn)腫瘤基因c-Fos和c-Jun的表達(dá),具有較好的應(yīng)用安全性。通過序列分析了解了KGF的關(guān)鍵序列。 第二部分KGF噬菌體活性肽構(gòu)建展示及離體實(shí)驗(yàn) 目的依據(jù)第一部分生物淘選和離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,構(gòu)建pComb3-KGF噬菌粒,應(yīng)用噬菌體展示技術(shù)獲得KGF噬菌體活性肽,檢測其對(duì)人口腔黏膜上皮細(xì)胞的生物學(xué)作用。 方法以噬菌體pComb3為載體,選取載體的重鏈作為基因插入位置,以Spel和Xhol作為限制性內(nèi)切酶；依據(jù)生物淘選和離體實(shí)驗(yàn)的結(jié)果,選取4個(gè)序列,設(shè)計(jì)引物；培養(yǎng)和保存人口腔黏膜上皮細(xì)胞,提取人口腔黏膜上皮細(xì)胞總RNA,應(yīng)用RT-PCR方法獲得目的基因；Spel和Xhol雙酶切目的基因及噬菌粒pComb3,將目的基因亞克隆至噬菌粒pComb3;應(yīng)用噬菌體呈現(xiàn)技術(shù),將插入的目的基因展示于噬菌體表面,獲得KGF噬菌體活性肽；抽提純化噬菌體DNA,進(jìn)行酶切、PCR和測序鑒定；應(yīng)用MTT方法檢測KGF噬菌體活性肽促進(jìn)人口腔黏膜上皮細(xì)胞增殖的作用；應(yīng)用免疫熒光方法檢測KGF噬菌體活性肽的細(xì)胞親和力；應(yīng)用RT-PCR方法檢測KGF噬菌體活性肽對(duì)KGFR、人防御素β3、c-Fos和c-Jun的表達(dá)水平的影響。 結(jié)果應(yīng)用RT-PCR方法獲得目的的基因,并構(gòu)建在噬菌粒pComb3中,目的基因成功表達(dá)于載體表面；酶切、PCR和測序結(jié)果證實(shí)目的基因己成功構(gòu)建在載體中；MTT結(jié)果顯示4種KGF噬菌體活性肽能夠促進(jìn)人口腔黏膜上皮細(xì)胞增殖；免疫熒光檢測結(jié)果顯示4種KGF噬菌體活性肽具有較好的細(xì)胞親和力；RT-PCR結(jié)果顯示KGF及兩種KGF噬菌體活性肽能夠促進(jìn)KGFR的表達(dá),KGF及3種KGF噬菌體活性肽能夠促進(jìn)人防御素β3的表達(dá),4種KGF噬菌體活性肽促進(jìn)c-Fos和c-Jun表達(dá)的作用均弱于野生型的KGF。 結(jié)論成功構(gòu)建展示獲得KGF噬菌體活性肽,能夠顯著促進(jìn)人口腔黏膜上皮細(xì)胞增殖,可能有助于控制創(chuàng)面感染,并具有較好的應(yīng)用安全性。 第三部分KGF噬菌體活性肽修復(fù)放射性口炎的實(shí)驗(yàn)研究 目的建立大鼠放射性口炎模型,將KGF噬菌體活性肽用于治療大鼠放射性口炎,促進(jìn)口腔潰瘍的愈合。 方法采用瓦里安23-EX加速器6MVX線,源皮距100cm,照射野10×10cm2,機(jī)架角180。,單次20GY照射,吸收劑量率為40CGy/min,照射時(shí)間6分鐘。清潔級(jí)雄性Wistar大鼠25只,隨機(jī)抽出20只以上述方法進(jìn)行投照,剩余5只作為對(duì)照組。每天觀察大鼠的一般情況、體重變化、舌及頰部口腔黏膜的變化,對(duì)口腔黏膜的紅斑(充血)、糜爛和潰瘍等主要體征進(jìn)行評(píng)估。照射3、6和9天后隨機(jī)處死2只大鼠并做病理分析,以明確建立大鼠放射性口腔黏膜炎模型的最佳條件。然后,按照己確認(rèn)的最佳條件取20只Wistar大鼠建立放射性口腔黏膜炎模型,隨機(jī)抽出15只放射性口腔黏膜炎Wistar實(shí)驗(yàn)鼠,在照射第3天(A組)后開始出現(xiàn)充血水腫時(shí),第6天(B組)后開始出現(xiàn)小面積潰瘍時(shí),第9天(C組)后出現(xiàn)大面積潰瘍時(shí),皮下注射KGF噬菌體活性肽1mg/kg/d,連續(xù)5天,每天觀察大鼠一般情況、體重變化,頰部及舌部口腔黏膜炎的愈合情況,并做病理分析。剩余5只作為對(duì)照組。 結(jié)果共有20只大鼠接受照射,照射20Gy后第一天攝食、飲水量無明顯變化,第二天開始出現(xiàn)每日攝食、飲水量減少。體重呈緩慢下降,照射結(jié)束后9-12天體重下降到最低點(diǎn),以后緩慢回升。舌部和頰部口腔黏膜在單次照射20Gy后第3天開始出現(xiàn)充血水腫；鏡下見舌部棘細(xì)胞空泡變性,固有層有少量的炎癥細(xì)胞浸潤。照射后第6天時(shí)開始出現(xiàn)小潰瘍面；鏡下見舌部絲狀乳頭脫落,棘細(xì)胞變性、脫落,固有層少量炎癥細(xì)胞浸潤：頰黏膜表面上皮細(xì)胞脫落。照射結(jié)束后9天時(shí),舌部和頰部出現(xiàn)大的潰瘍面,舌部上皮脫落；鏡下見舌部絲狀乳頭脫落,基底細(xì)胞、棘細(xì)胞變性,固有層有大量的炎癥細(xì)胞浸潤；頰黏膜上皮表層細(xì)胞脫落。皮下注射KGF噬菌體活性肽后A組未出現(xiàn)潰瘍；B組潰瘍未見明顯擴(kuò)大,并在治療結(jié)束后3天潰瘍基本愈合。C組潰瘍稍微擴(kuò)大,并在治療結(jié)束后6天潰瘍基本愈合；鏡下見治療后舌部上皮結(jié)構(gòu)完整,固有層仍可見少量炎癥細(xì)胞浸潤。對(duì)照組3周后潰瘍基本愈合。 結(jié)論通過放療所致大鼠放射性口炎模型的動(dòng)物試驗(yàn),研究KGF噬菌體活性肽防治放射性口炎的效果及最佳的應(yīng)用途徑、干預(yù)時(shí)機(jī)和安全有效劑量。結(jié)果顯示KGF噬菌體活性肽能有效降低口腔黏膜炎的嚴(yán)重程度,促進(jìn)創(chuàng)面上皮化,盡早封閉創(chuàng)面,縮短愈合時(shí)間,有效地預(yù)防放射性口炎發(fā)生。 【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2012
【分類號(hào)】：R739.8

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本文編號(hào)：2712059