發(fā)布時(shí)間：2020-06-13 19:30

【摘要】：目的:顳下頌關(guān)節(jié)炎(temporomandibularjointosteoaritis,TMJ-OA)是口腔頜面部常見(jiàn)的疾病之一,常伴顳下頜關(guān)節(jié)區(qū)疼痛;張口受限;伴有骨贅增生時(shí),可有摩擦音等癥狀,嚴(yán)重影響患者的日常生活。目前的研究現(xiàn)狀多集中在軟骨細(xì)胞的自噬、信號(hào)通路的失調(diào)、節(jié)律基因等方面。但其具體的發(fā)病機(jī)制尚未完全明了。非編碼小RNA(miRNA)是一種長(zhǎng)度約22-24個(gè)核苷酸的小RNA,其通過(guò)與靶基因mRNA結(jié)合抑制蛋白翻譯過(guò)程。非編碼小RNA自發(fā)現(xiàn)已25余年,因其眾多的靶基因?yàn)樵┗蚣耙职┗?其在腫瘤領(lǐng)域而備受關(guān)注。但其在關(guān)節(jié)炎的研究則鮮有報(bào)道。本課題目的是探討miR-21與顳下頜關(guān)節(jié)炎(temporomandibular joint osteoaritis,TMJ-OA)的關(guān)系,明確miR-21通過(guò)靶向TIMP-3來(lái)調(diào)控IL-6介導(dǎo)的小鼠髁突軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的降解及VEGF-A的表達(dá)。方法:(1)采用3-4周齡C57小鼠提取髁突軟骨細(xì)胞,在無(wú)菌環(huán)境下,采用“脫帽法”分離小鼠髁突,將小鼠髁突軟骨沖洗,剪碎,仔細(xì)剪切至1r丨mm3的碎塊。軟骨塊中加入0.25%的胰酶置于37℃恒溫箱孵育10分鐘,然后,在濃度為0.25%的Ⅰ型膠原酶和0.25%的dispase酶Ⅱ中消化2小時(shí)。將提取的原代的小鼠髁突軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng),鏡檢觀察其生長(zhǎng)變化情況和細(xì)胞形態(tài),并用細(xì)胞形態(tài)學(xué)方法鑒定分離、培養(yǎng)的細(xì)胞為髁突軟骨細(xì)胞。將提取的小鼠髁突軟骨細(xì)胞隨機(jī)分為四組,即miR-21 inhibitor NC組,miR-21 inhibitor組,miR-21 inhibitor NC+IL-6組,miR-21 inhibitor+IL-6組。使用CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞增殖活性,9孔培養(yǎng)板每孔接種細(xì)胞5×103個(gè),每孔加10ul細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑kit-8,分別于6h、48h細(xì)胞計(jì)數(shù),酶標(biāo)儀在450nm處記錄吸光值;(2)qRT-PCR和Western b1ot檢測(cè)miRNA-21模擬物其抑制劑對(duì)TIMP-3、MMP-9、VEGF-1、col-1、AggmRNA及蛋白表達(dá)的影響(3)取第2代處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期髁突軟骨細(xì)胞隨機(jī)分為四組,分別用O、1、5、1Ong/mlIL-6處理24小時(shí),對(duì)各組之間TIMP-3、Agg、col-蛋白和mRNA表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè),并篩選出能造成髁突軟骨細(xì)胞炎性狀態(tài)的IL-6最佳濃度。Western blot檢測(cè)miR-21 inhibitor NC組,miR-21 inhibitor組,miR-21 inhibitor NC+IL-6組,miR-21 inhibitor+IL-6組,中TIMP-3、MMP-9、VEGF-、col-1、agg蛋白的表達(dá);microRNA靶基因數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)miRNA-21靶基因TIMP-3,雙熒光素酶標(biāo)記實(shí)驗(yàn)用于驗(yàn)證miR-21的靶基因;(4)驗(yàn)證TIMP-3是否參與miR-21對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的作用,該實(shí)驗(yàn)分為兩部分,第一部分分組:miR-21-NC+TIMP-3-NC組、miR-21-NC+siTIMP-3組、miR-21-inhibitor+siTIMP-3-NC組、miR-21-inhibitor+siTIMP-3組;第二部分各組應(yīng)用10ng/ml IL-6以驗(yàn)證其在急性炎癥中的作用,白介素6刺激24h后,rt-PCR和western用于測(cè)定TIMP-3,2型膠原,agg,VEGF-A和MMP-9的mRNA和蛋白的在各組的表達(dá)。結(jié)果:(1)鏡檢見(jiàn)分離的原代小鼠髁突軟骨細(xì)胞呈卵圓形,形態(tài)規(guī)則,體外培養(yǎng)5—7天后,可見(jiàn)呈“鋪路石”樣外觀,形態(tài)飽滿。(2)miR-21 inhibitor對(duì)比miR-21-NC組,在mRNA和蛋白水平上,MMP9,VEGF-A表達(dá)顯著下調(diào),而coll,Agg,TIMP-3表達(dá)顯著上調(diào)。miR-21 mimic對(duì)比miR-21-NC組顯著上調(diào)MMP-9、VEGF-A表達(dá),下調(diào)col-l、Agg的表達(dá);(3)Agg,col-1,TIMP-3表達(dá)量隨IL-6濃度上調(diào)而下降;測(cè)定WT組,miR-21敲除組,WT+IL-6組和miR-21敲除+IL-6組中特定基因的表達(dá),結(jié)果提示在10ng/ml IL-6刺激下,較wt組,miR-21敲除組中Agg,TIMP-3表達(dá)顯著上調(diào),MMP-9表達(dá)顯著下調(diào)。下調(diào)miR-21表達(dá)可延緩IL-6介導(dǎo)的急性炎癥,減少細(xì)胞外基質(zhì)的降解。在IL-6刺激下,相較于miR-21 inhibitor組,miR-21 inhibitor-NC組VEGF-A表達(dá)量顯著下調(diào);同時(shí)CCK-8增殖試驗(yàn)證實(shí)miR-21 inhibitor組的軟骨細(xì)胞增值速度優(yōu)于miR-21 inhibitor-NC組。miR-21 inhibitor-NC+IL-6組細(xì)胞的生長(zhǎng)速度慢于miR-21 inhibitor +IL-6組。(4)軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)染TIMP-3 siRNA后,TIMP-3蛋白和mRNA表達(dá)量顯著下調(diào),并可下調(diào)col-1,Agg的表達(dá)和上調(diào)VEGF-A和MMP-9的表達(dá)。對(duì)比共轉(zhuǎn)染miR-21-inhibitor和siTIMP-3-NC組,共轉(zhuǎn)染miR-21-inhibitor和si-TIMP3組可顯著下調(diào)Agg,coll的蛋白和mRNA表達(dá),同時(shí)上調(diào)VEGF-A和MMP-9的表達(dá)。4組細(xì)胞均應(yīng)用10ng/ml IL-6刺激24h,可產(chǎn)生與未應(yīng)用IL-6刺激組相似的效果.
【圖文】：

在ＣＣＫ－８實(shí)驗(yàn)中，小鼠髁突軟骨細(xì)胞轉(zhuǎn)染ｍｉＲ－２〗ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ后，相較于對(duì)照組，逡逑細(xì)胞增殖加快，兩組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（Ｐ＜０．０５）。給與１０ｎｇ／ｍｌ邋ＩＬ－６刺激后，逡逑ＣＣＫ－８試驗(yàn)顯示出相似的結(jié)果（圖４）。逡逑１．４．實(shí)驗(yàn)三ＭｉＲ－２１對(duì)ＩＬ－６介導(dǎo)的炎性髁突軟骨的細(xì)胞外基質(zhì)的影響逡逑１．４．１實(shí)驗(yàn)方法逡逑（１）�。校插澹停茫茫�，隨機(jī)分為４組，分組如表２逡逑表２．邋ＭｉＲ－２１對(duì)炎性髁突軟骨的關(guān)鍵蛋白及細(xì)胞外基質(zhì)的影響實(shí)驗(yàn)分組逡逑分組邐ＭｉＲ－２１邋ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ邋ＭｉＲ－２１邋ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ邋ＭｉＲ－２１邋ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ邋ＭｉＲ－２１邋ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ逡逑ＮＣ邐ＮＣ＋邋ＩＬ－６邐＋邋ＩＬ－６逡逑（２）其余步驟同１．２．１逡逑１．４．２邋Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ邋檢測(cè)邋Ｔｉｍｐ－３邋及邋Ａｇｇ、Ｃｏｌ－１、ＭＭＰ－９邋和邋ＶＥＧＦ－Ａ邋的蛋白表達(dá)水逡逑平逡逑同邋１．２．３逡逑１．４．２結(jié)果逡逑２５逡逑

邐ｒｖｉｏｒ逡逑圖６逡逑ＭｉＲＢａｓｅ提示：ｍｉＲ－２１與ＴＩＭＰ－３有互補(bǔ)序列（圖６Ａ）。逡逑Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ分析顯示轉(zhuǎn)入ＭｉＲ－２１邋ｍｉｍｉｃ會(huì)有效抑制Ｔｉｍｐ－３的表達(dá)，而其逡逑ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ會(huì)增高Ｔｉｍｐ－３的表達(dá)（圖６Ｂ）。逡逑熒光素酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示（圖６Ｃ），ＭｉＲ－２１會(huì)有效抑制ＷＴ中ＴＩＭＰ－３的熒光素逡逑酶效應(yīng)，而在突變型中，，我們阻斷了邋ＭｉＲ－２１的活性位點(diǎn)，從而阻止了次抑制效逡逑應(yīng)。Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ分析也顯示轉(zhuǎn)入ＭｉＲ－２１邋ｍｉｍｉｃ會(huì)有效抑制Ｔｉｍｐ－３的表達(dá)，而逡逑其ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ會(huì)增高Ｔｉｍｐ－３的表達(dá)。逡逑２邋實(shí)驗(yàn)二ＭｉＲ－２１靶向ＴＩＭＰ－３調(diào)控ＩＬ－６介導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)的降解逡逑２．１實(shí)驗(yàn)試劑與儀器逡逑２．邋１．１主要試劑逡逑Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ邋Ｍｕｒｉｎｅ邋ＩＬ－６（Ｐｅｐｒｏｔｅｃｈ，美國(guó)）；逡逑Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ邋２０００邋ｒｅａｇｅｎｔ邋（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，邋ＵＳＡ）逡逑Ｉ型膠原兔抗小鼠多克隆抗體（Ｓｉｇｍａ，美國(guó)）；逡逑２９逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R782.6

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本文編號(hào)：2711633