【摘要】：目的:研究不同濃度CGF(Concentrated Growth Factors,濃縮生長(zhǎng)因子)、PRF(Plate Rich Fibrin,富血小板纖維蛋白)提取液對(duì)h DPSCs(human Dental Pulp Stem Cells,人牙髓干細(xì)胞)增殖的影響;獲得最佳促增殖濃度,探討該濃度提取液對(duì)牙髓干細(xì)胞遷移、成牙本質(zhì)分化及相關(guān)因子表達(dá)的影響。方法:(1)組織塊結(jié)合酶消化法獲得牙髓細(xì)胞,單克隆法從中獲得h DPSCs,采用免疫組化染色檢測(cè)波形絲蛋白和角蛋白的表達(dá),流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)h DPSCs表面特異性標(biāo)志物,成骨及成脂分化誘導(dǎo)鑒定其細(xì)胞干性。(2)反復(fù)凍融法制備CGF、PRF凝膠提取液,酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)各提取液中TGF-β1和PDGF-AA的濃度;分別使用對(duì)照組:10%FBS組,實(shí)驗(yàn)組:10%、20%、30%、40%CGF和PRF提取液組與h DPSCs共培養(yǎng),CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性,獲得最佳促h DPSCs增殖濃度。(3)細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)比較10%FBS、20%CGF、20%PRF對(duì)h DPSCs遷移的影響。(4)茜素紅染色、ALP染色和ALP活性試劑盒分別檢測(cè)10%FBS、20%CGF、20%PRF對(duì)h DPSCs成骨誘導(dǎo)分化的影響。(5)q RT-PCR檢測(cè)10%FBS、20%CGF、20%PRF對(duì)h DPSCs成牙本質(zhì)誘導(dǎo)分化過(guò)程中相關(guān)特異性基因表達(dá)的影響。結(jié)果:(1)本實(shí)驗(yàn)條件下使用酶消化法結(jié)合單克隆法從新鮮離體牙中獲得具有間充質(zhì)干細(xì)胞特性的h DPSCs;(2)100%CGF、100%PRF提取液中,TGF-β1和PDGF-AA的含量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,10%、20%、30%、40%CGF和PRF提取液促進(jìn)h DPSCs增殖能力不同,20%CGF組和20%PRF組促進(jìn)h DPSCs增殖能力最強(qiáng)(P0.05),20%CGF組促進(jìn)h DPSCs增殖能力比20%PRF組強(qiáng)(P0.05);(3)與對(duì)照組相比,20%CGF和20%PRF均抑制h DPSCs遷移能力(P0.05),20%PRF組抑制h DPSCs遷移能力最強(qiáng)(P0.05);(4)茜素紅染色和ALP染色結(jié)果顯示在促進(jìn)h DPSCs成骨分化能力由強(qiáng)到弱依次為20%PRF組、20%CGF組、10%FBS組,ALP活性檢測(cè)顯示20%PRF組和20%CGF組促進(jìn)h DPSCs成骨分化能力相對(duì)于對(duì)照組強(qiáng)(P0.05),20%PRF組優(yōu)于20%CGF組(P0.05);(5)q RT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示:第3天時(shí),20%CGF組DSPP表達(dá)量最高(P0.05);20%PRF組BMP-2和TGF-β1表達(dá)量最高(P0.05),各組之間DMP-1表達(dá)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;第7天時(shí),20%PRF組高表達(dá)TGF-β1和DMP-1(P0.05),各組之間DSPP、BMP-2表達(dá)量無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;第14天時(shí),20%CGF組和20%PRF組DSPP、BMP-2、TGF-β1、DMP-1表達(dá)量與對(duì)照組相比,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,其中20%CGF組DSPP、BMP-2表達(dá)量最高(P0.05),20%PRF組中TGF-β1、DMP-1表達(dá)量最高(P0.05)。結(jié)論:(1)本實(shí)驗(yàn)條件下成功獲得具有良好增殖和分化能力的h DPSCs;(2)10%、20%、30%、40%CGF和PRF提取液促進(jìn)h DPSCs增殖,20%CGF組促h DPSCs增殖能力更強(qiáng);(3)20%CGF和20%PRF均抑制h DPSCs遷移能力,20%PRF組抑制h DPSCs遷移能力更強(qiáng);(4)20%CGF和20%PRF均促進(jìn)h DPSCs成骨分化能力,20%PRF組促進(jìn)h DPSCs成骨分化能力比20%CGF組強(qiáng);(5)20%CGF、20%PRF提取液均能促進(jìn)h DPSCs成牙本質(zhì)分化,20%CGF組促進(jìn)DSPP、BMP-2基因表達(dá);20%PRF組促進(jìn)TGF-β1、DMP-1基因表達(dá)。
【圖文】：

置顯微鏡觀察礦化結(jié)節(jié)并拍照。2.6.2 成脂分化誘導(dǎo)取第四代細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，以每孔 1×104個(gè)細(xì)胞接種至 6 孔板，隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組，每組設(shè)置 3 副孔。細(xì)胞增殖至 80%匯合態(tài)時(shí)，實(shí)驗(yàn)組改為成脂誘導(dǎo)液（含主要成份為 1 μmol/L地塞米松、10 μmol/L胰島素、200 μmol/L 吲哚美辛、0.5 mmol/L IBMX、10%FBS、1%雙抗的 α-MEM 培養(yǎng)基），對(duì)照組只加10%FBS和 1%雙抗的 α-MEM培養(yǎng)基，每孔各加培養(yǎng)液 2.5 mL，每 2天換一次液，4 周后棄培養(yǎng)液，PBS 洗 3 遍；4％多聚甲醛室溫固定 20 min；PBS 洗 3 遍；0.21%油紅“O”染色，，倒置顯微鏡下觀察脂肪粒并拍照。3 結(jié)果3.1 牙髓細(xì)胞A B

細(xì)胞爬片免疫組化結(jié)果：抗角蛋白（Cytokeratin）陰性（圖 1.3 A），排源于上皮；抗波形絲蛋白（Vimentin）陽(yáng)性（圖 1.3 B），證明細(xì)胞來(lái)源。B： 抗 Vimentin 陽(yáng)性，×200A：抗 Cytokeratin 陰性，×200圖 1.3 牙髓干細(xì)胞細(xì)胞爬片免疫組化A B
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R78

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2710905