【摘要】：背景:隨著時代的發(fā)展,種植體修復(fù)已成為越來越多牙缺失患者的選擇方式,然而由于外傷,系統(tǒng)系疾病如糖尿病,重度牙周炎引起牙槽骨吸收、喪失是影響種植體修復(fù)的關(guān)鍵因素。當(dāng)前,臨床常用的治療手段包括自體骨、同種異體骨、異種骨和人工骨移植等方式,但均不是最理想的解決方式。骨組織工程(Bone tissue engineering)通過在體外構(gòu)建細(xì)胞-支架復(fù)合材料,用于替代上述骨移植材料,被認(rèn)為是當(dāng)前最具潛力的骨再生方式。對于種子細(xì)胞,與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone marrow Mesenchymal Stem Cells,BMSCs)相比,脂肪源性干細(xì)胞(Adipose-Derived Mesenchymal Stem Cells,ASCs)具有多向分化潛能的同時,且來源豐富,取材方便,損傷小,成為備受關(guān)注的種子細(xì)胞。此外,細(xì)胞膜片技術(shù)將細(xì)胞高度密集培養(yǎng)成膜片的形式,避免傳統(tǒng)細(xì)胞懸液接種到支架上導(dǎo)致的細(xì)胞大量流失,是組織工程中被證實行之有效的方法。此外,通過采集外周血液經(jīng)高速離心后獲得的富血小板纖維蛋白(platelet-rich fibrin,PRF)呈三維網(wǎng)絡(luò)立體結(jié)構(gòu),富含豐富的血小板和生長因子,可作為組織工程中生長因子的來源,提高ASCs細(xì)胞膜片的成骨能力。目的:本實驗研究目的旨在探索PRF膜片對ASCs增殖、分化的影響,為臨床骨缺損修復(fù)運(yùn)用PRF提供臨床依據(jù);探索ASCs膜片復(fù)合PRF膜片雙膜復(fù)合體在種植體周骨缺損的骨再生修復(fù)及骨整合的影響。方法:1.分離培養(yǎng)犬ASCs,并通過成骨、成脂以及成軟骨誘導(dǎo)分化來鑒定脂肪干細(xì)胞。利用膜片培養(yǎng)液連續(xù)誘導(dǎo)培養(yǎng)ASCs構(gòu)建細(xì)胞膜片,HE染色和電鏡觀察膜片結(jié)構(gòu)。2.抽取來自同一供體的犬靜脈血離心制備PRF,并做HE染色、電鏡觀察鑒定;將PRF作用于ASCs,CCK-8檢測PRF對ASCs的增殖影響;ALP染色觀察PRF對ASCs成骨分化的影響和RT-PCR檢測成骨相關(guān)基因的表達(dá)情況。并在電鏡下觀察PRF與ASCs膜片復(fù)合的情況。3.體內(nèi)實驗:拔除比格犬雙側(cè)下頜第三、第四前磨牙,于種植窩一側(cè)制備種植體周圍骨缺損模型(4×4×3mm),種植體植入后,于骨缺損內(nèi)隨機(jī)植入以下材料:(A)ASCs膜片/PRF組:ASCs膜片復(fù)合PRF膜;(B)ASCs膜片組:僅植入ASCs膜片;(D)PRF組:僅植入PRF膜;(D)空白對照組:無材料植入。于術(shù)后4W,8W取材,活體熒光雙標(biāo)檢測種植體骨缺損內(nèi)骨礦化沉積率(MAR),Micro-CT掃描分析骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV),骨小梁數(shù)目(Tb.N),骨小梁厚度(Tb.Th),骨小梁間距(Tb.Sp)。生物力學(xué)實驗檢測各實驗組的最大推力,評價骨質(zhì)量。硬組織染色分析種植體骨缺損內(nèi)骨填充率(BF)和骨結(jié)合率(BIC)。4.統(tǒng)計學(xué)分析,計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(?x±SD)表示,運(yùn)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析,P0.05表示有顯著性差異。結(jié)果:1.經(jīng)培養(yǎng)鑒定ASCs具有多向分化潛能,并成功構(gòu)建出ASCs細(xì)胞膜片,HE染色顯示ASCs膜片由2-4層細(xì)胞構(gòu)成,電鏡觀察細(xì)胞與細(xì)胞間有大量細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)。2.比格犬靜脈血成功制備出PRF,呈乳白色,凝膠狀。HE及電鏡觀察顯示PRF由疏松多孔的膠原纖維組成的三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu),大量的白細(xì)胞、血小板網(wǎng)絡(luò)其間。CCK-8結(jié)果顯示PRF組OD值從第3天后明顯高于對照組(P0.05)。經(jīng)成骨誘導(dǎo)后,與PRF共培養(yǎng)的ASCs,堿性磷酸酶活性表達(dá)增強(qiáng),成骨基因表達(dá)均顯著升高(P0.05)。3.種植體周骨缺損模型成功建立。術(shù)后結(jié)果顯示,空白對照組僅有少量新骨生成ASCs膜片/PRF組、ASCs膜片組和PRF組均有新生骨,其中ASCs膜片/PRF組新生骨顯著。Micro-CT顯示,4周和8周時各組的骨缺損修復(fù)率即BV/TV(%)分別為:ASCs膜片/PRF組60.90±4.83%,80.85±3.93%,ASCs膜片組9.22±6.38%,68.43±2.70%,PRF組46.92±6.70%,57.48±1.47%,空白組32.89±2.22%,39.00±9.57%,ASCs膜片/PRF組與其他組相比均有統(tǒng)計學(xué)差異。組織形態(tài)學(xué)分析顯示ASCs膜片/PRF組中BF,BIC均明顯增加。熒光雙標(biāo)檢測種植體骨缺損周圍骨礦化沉積率(MAR)和生物力學(xué)實驗結(jié)果顯示ASCs膜片/PRF組在8周時明顯增加。(P0.05)結(jié)論:1.PRF體外可促進(jìn)ASCs增殖和成骨向分化;2.將ASCs細(xì)胞膜片與PRF膜復(fù)合運(yùn)用于種植體周圍骨缺損中,可顯著促進(jìn)骨再生修復(fù)和種植體周圍骨整合。本研究進(jìn)一步推進(jìn)了以細(xì)胞膜片為基礎(chǔ)的組織工程在骨再生中的發(fā)展,為組織工程骨進(jìn)一步研究和臨床應(yīng)用提供了實驗依據(jù)。
【圖文】：

掃描電鏡 Hitachi，日本1.2 實驗方法1.2.1 ASCs 體外分離、培養(yǎng)比格犬稱重，按 1ml/kg、3%戊巴比妥鈉對比格犬進(jìn)行肌肉注射，全麻后，于比格犬腹股溝處備皮、消毒，切開皮膚及皮下組織，過程中注意止血，切取約 5ml脂肪組織放入含有雙抗的 PBS 溶液中，轉(zhuǎn)入超凈工作臺，PBS 反復(fù)沖洗，去除筋膜血管，充分剪碎，加入 0.1%I 型膠原酶，37℃恒溫震蕩消化 40 分鐘。加入等體積 DMEM-F12（含 10%FBS、1%雙抗）終止消化，，置入離心機(jī)中，1000r/min，離心 5 分鐘，棄上層組織，200 目篩網(wǎng)過濾，再次離心后，DMEM-F12 重懸，移至25cm 培養(yǎng)瓶中，5% CO2、37℃細(xì)胞浮箱中常規(guī)培養(yǎng)，24 小時后可見原代細(xì)胞零星分布，每 2-3 天進(jìn)行細(xì)胞換液，待細(xì)胞生長達(dá)到約 90%時進(jìn)行細(xì)胞傳代，顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照記錄。

圖 1-2ASCs 細(xì)胞生長形態(tài)（A：P0 代細(xì)胞×40；B：P3 代細(xì)胞×100）Figure 1-2 Morphology of ASCs (A：P0×40, B:P3×100).2 ASCs 的多向分化鑒定成骨誘導(dǎo)：ASCs 經(jīng)成骨誘導(dǎo)后細(xì)胞形態(tài)呈短梭形，細(xì)胞外基質(zhì)分泌增多，胞顏色加深，開始有鈣鹽沉積。3 周后經(jīng)茜素紅染色，可見紅染的團(tuán)塊狀鈣化結(jié)節(jié)。明 ASCs 具有成骨分化的能力。成脂誘導(dǎo)：經(jīng)過成脂誘導(dǎo)的 ASCs，細(xì)胞由長梭逐漸變圓，細(xì)胞內(nèi)可見小脂滴形成，隨著誘導(dǎo)時間的延長，脂滴逐漸變大。油 O 染色鏡下顯示細(xì)胞中可見許多大小不一的橘紅色脂滴，說明細(xì)胞分化成了脂細(xì)胞。成軟骨誘導(dǎo)：經(jīng)成軟骨誘導(dǎo) 2 周后，阿利新藍(lán)染色鏡下觀察可見細(xì)胞內(nèi)見藍(lán)色胞漿，說明細(xì)胞具有成軟骨向分化的能力。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R783.6

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2710400