【摘要】：目的 構(gòu)建并鑒定人野生型PTEN基因綠色熒光蛋白真核表達載體，脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的人舌鱗癌SCC-4細胞系，觀察外源性PTEN基因穩(wěn)定表達對人舌鱗癌細胞增殖的影響，并初步探討其相關(guān)機制，為進一步研究PTEN基因與舌鱗癌生物學(xué)行為之間的關(guān)系奠定基礎(chǔ)，同時為舌鱗癌的基因治療提供實驗依據(jù)。 方法 1、提取人hela細胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA鏈，PCR擴增后定向克隆至pMD18-T載體，酶切鑒定并篩選含有PTEN基因的陽性重組載體。分別雙酶切pEGFP-N1空載體及pT-PTEN重組載體，獲得的大小片段在DNA聚合酶作用下連接，產(chǎn)物經(jīng)雙酶切及測序法鑒定。 2、重組質(zhì)粒經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的人舌鱗癌SCC-4細胞系，分別于轉(zhuǎn)染24、48、72h在熒光顯微鏡下觀察各組細胞內(nèi)綠色熒光蛋白的表達。實驗分為三組：pEGFP-PTEN重組載體轉(zhuǎn)染組（pEGFP-PTEN-SCC-4），pEGFP-N1空載體轉(zhuǎn)染組（pEGFP-N1-SCC-4）及未轉(zhuǎn)染組（SCC-4）。 3、轉(zhuǎn)染48h后，經(jīng)G418抗性篩選，獲得穩(wěn)定表達PTEN基因的SCC-4細胞，RT-PCR和Western blotting檢測各組細胞PTEN基因mRNA及蛋白表達情況。 4、MTT法檢測各組細胞增殖能力并繪制細胞生長曲線，觀察PTEN基因在體外抑制腫瘤的效應(yīng)。 結(jié)果 1、雙酶切及測序法對重組載體進行鑒定，雙酶切結(jié)果顯示出現(xiàn)大小為1200bp左右的目標條帶，測序結(jié)果與GeneBank中PTEN序列完全一致，表明pEGFP-PTEN重組載體構(gòu)建成功。 2、經(jīng)脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染24h后，熒光顯微鏡下見： pEGFP-PTEN-SCC-4組pEGFP-N1-SCC-4組細胞有綠色熒光表達，熒光強弱不均（基因轉(zhuǎn)入的拷貝數(shù)略有差異），SCC-4組未見熒光，表明pEGFP-PTEN-SCC-4組和pEGFP-N1-SCC-4組有綠色熒光蛋白基因?qū)�。分別于轉(zhuǎn)染后24、48、72h觀察pEGFP-PTEN-SCC-4和pEGFP-N1-SCC-4兩組綠色熒光表達情況，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染48h表達最明顯。 3、經(jīng)G418抗性篩選可見陽性克隆，擴增培養(yǎng)后RT-PCR結(jié)果示：3組細胞在1200bp處均有目標條帶出現(xiàn)，pEGFP-PTEN-SCC-4組條帶明顯增粗變亮，相對OD值為0.95±0.04，與pEGFP-N1-SCC-4組（OD值為0.26±0.02）和SCC-4組（OD值為0.24±0.03）比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.01）。Western blotting結(jié)果顯示：3組細胞在55kD處均有目標條帶出現(xiàn)，pEGFP-PTEN-SCC-4組條帶明顯增粗變亮，相對OD值為1.45±0.14，與pEGFP-N1-SCC-4組（OD值為0.17±0.02）和SCC-4組（OD值為0.15±0.03）比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.01）。而pEGFP-N1-SCC-4組和SCC-4組細胞RT-PCR及Western blotting結(jié)果比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（p＞0.05）。 4、生長曲線結(jié)果顯示：pEGFP-PTEN-SCC-4細胞的生長速度明顯慢于pEGFP-N1-SCC-4和SCC-4組細胞，說明外源性PTEN能抑制SCC-4細胞的生長。pEGFP-PTEN-SCC-4組在第1、2天的抑制率與對照組比較無統(tǒng)計學(xué)差異（p＞0.05）；從第3天開始抑制率有明顯差異（p＜0.01），即與pEGFP-N1-SCC-4和SCC-4組比較，pEGFP-PTEN-SCC-4組細胞生長明顯受到抑制。pEGFP-N1-SCC-4和SCC-4組細胞之間抑制率在第1～7天均無統(tǒng)計學(xué)差異（p＞0.05）。 結(jié)論 1、pEGFP-PTEN重組表達載體構(gòu)建成功。 2、外源性PTEN基因成功轉(zhuǎn)染體外培養(yǎng)的人舌鱗癌SCC-4細胞。 3、外源性PTEN基因穩(wěn)定表達可以明顯抑制SCC-4細胞的生長。 4、PTEN基因有望成為人舌鱗癌基因治療的新靶點。
【圖文】：

Total 10μl2、pEGFP-PTEN 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化具體方法同上，，同時設(shè)立感受態(tài)細菌為陰性對照，pEGFP-Nl 為陽性對照。3、轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定挑取分離良好的 8 個單菌落分別接種于 5ml LB 液體抗性培養(yǎng)基中擴增培養(yǎng)，產(chǎn)物經(jīng)雙酶切鑒定。測序由武漢英騏生物技術(shù)有限公司完成。4、pEGFP-PTEN 重組質(zhì)粒的大量培養(yǎng)將含有重組質(zhì)粒的菌液 200μl，加入 200ml 的 LB 液體抗性培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)，按大量提取質(zhì)粒試劑盒說明書進行質(zhì)粒抽提，產(chǎn)物于-20℃保存?zhèn)溆�。結(jié)果一、重組載體構(gòu)建所需質(zhì)粒圖譜（圖 1-1、1-2）

Total 10μl2、pEGFP-PTEN 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化具體方法同上，同時設(shè)立感受態(tài)細菌為陰性對照，pEGFP-Nl 為陽性對照。3、轉(zhuǎn)化子的篩選和鑒定挑取分離良好的 8 個單菌落分別接種于 5ml LB 液體抗性培養(yǎng)基中擴增培養(yǎng)，產(chǎn)物經(jīng)雙酶切鑒定。測序由武漢英騏生物技術(shù)有限公司完成。4、pEGFP-PTEN 重組質(zhì)粒的大量培養(yǎng)將含有重組質(zhì)粒的菌液 200μl，加入 200ml 的 LB 液體抗性培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)，按大量提取質(zhì)粒試劑盒說明書進行質(zhì)粒抽提，產(chǎn)物于-20℃保存?zhèn)溆�。結(jié)果一、重組載體構(gòu)建所需質(zhì)粒圖譜（圖 1-1、1-2）
【學(xué)位授予單位】：遼寧醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R739.86

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 王莉紅;張弘彬;劉婷姣;耿莉;劉麗軍;王耀;;H-ras和pERK1/2蛋白在舌鱗癌中的表達及相互關(guān)系[J];中國醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2006年04期

本文編號：2708507