【摘要】： 癌癥是影響人類生存的重大疾病之一,口腔癌是頭頸部較常見的惡性腫瘤之一,它的發(fā)生發(fā)展是多因素、多階段的過程。研究表明,細胞的凋亡在口腔癌發(fā)生發(fā)展過程中起著十分重要的作用。HSP70、HSP90、p53及Survivin蛋白是該領(lǐng)域研究較多的相關(guān)蛋白,國內(nèi)外學(xué)者證實HSP70、HSP90、p53及Survivin蛋白在口腔鱗癌中均有異常表達。長期以來,有機熒光一直被用來標(biāo)記生物大分子以研究各種蛋白質(zhì)之間的相互作用及對細胞的功能的影響。但是由于有機熒光的一些缺點,例如激發(fā)光譜較窄、光穩(wěn)定性差、熒光壽命短等,限制了其作為標(biāo)記物在生物分子、細胞、體內(nèi)生物成像研究中的應(yīng)用。近年來半導(dǎo)體量子點(Quantum dot, QD)由于其獨特的光學(xué)性質(zhì)：激發(fā)波長的范圍寬且連續(xù)分布,而發(fā)射波長的范圍窄而且對稱分布,并且發(fā)光度強,有持久的光化學(xué)穩(wěn)定性等使其在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的分子、細胞及體內(nèi)的成像,尤其在腫瘤學(xué)的生物成像技術(shù)研究中,前景非常廣闊。國內(nèi)外未見利用量子點對口腔鱗癌細胞HSP70、HSP90、p53及Survivin蛋白進行研究報道。 第一章利用不同粒徑的量子點探針分別對人舌鱗癌Tca8113細胞中HSP90、p53及Survivin蛋白進行的免疫熒光標(biāo)記成像研究 目的 利用不同粒徑的量子點探針對人舌鱗癌細胞內(nèi)HSP90、p53和Survivin蛋白進行特異性熒光標(biāo)記 方法 1.用激光共聚焦顯微鏡對量子點(QD525nm、QD565nm及QD655nm)的熒光和形態(tài)進行觀察。 2.細胞培養(yǎng)：選用人舌癌Tca8113細胞。 3.細胞接種。 4.利用量子點(QD525nm、QD565nm及QD655nm)通過間接免疫熒光法,對人舌癌Tca8113細胞內(nèi)HSP90、p53和Survivin蛋白進行標(biāo)記,并在激光共聚焦顯微鏡下進行觀察識別。 結(jié)果 1.量子點的形態(tài)和熒光特點：在激光共聚焦顯微鏡下見QD525nm為近圓形的綠色熒光,QD655nm為近圓形的紅色熒光,QD565nm為近圓形的橙色熒光。 2.量子點QD525nm特異性標(biāo)記的HSP90在人舌癌Tca8113細胞漿、細胞核均有明顯表達,主要分布于胞漿內(nèi),表現(xiàn)為綠色熒光。量子點QD565nm特異性標(biāo)記的P53表現(xiàn)為橙色熒光,核膜及其周邊明顯表達,核內(nèi)少量分布。量子點QD655nm特異性標(biāo)記的Survivin表現(xiàn)為紅色熒光,主要分布于胞漿和核膜。 第二章量子點與FITC熒光強度、特異性以及光穩(wěn)定性方面的比較研究 目的 利用量子點和FITC同時對人舌鱗癌細胞中Survivin和HSP70蛋白進行雙重標(biāo)記熒光成像,并對兩種熒光素進行熒光強度、特異性以及光穩(wěn)定性比較研究 方法 1.細胞培養(yǎng)、細胞接種：選用人舌癌Tca8113細胞。 2.利用量子點與FITC分別標(biāo)記人舌癌Tca8113細胞內(nèi)HSP70,對兩種熒光素進行熒光強度、特異性比較。 3.利用量子點QD聯(lián)合FITC,通過雙重免疫熒光標(biāo)記法同時對人舌癌Tca8113細胞內(nèi)Survivin、HSP70蛋白進行特異性標(biāo)記后觀察識別,然后給予長時間連續(xù)高強度激發(fā),觀測上述熒光圖像的變化以及熒光強度值的改變,對兩種熒光素進行光穩(wěn)定性比較。 結(jié)果 1.QD525nm特異性標(biāo)記的HSP70在人舌癌Tca8113細胞漿、細胞核均有明顯表達,主要分布于胞漿內(nèi),表現(xiàn)為綠色熒光。與FITC標(biāo)記組相比較,HSP70細胞亞定位一致,但QD525nm標(biāo)記的熒光圖效果好,背景干凈,非特異性染色很少,特異性更好,熒光強度更強。 2.在激光共聚焦顯微鏡下觀察到舌癌細胞Survivin、HSP70蛋白均呈高表達。多色通道下所見,可見到3種不同顏色的熒光(黃、紅、綠),黃色熒光為紅色、綠色熒光重疊,表示該區(qū)域2種蛋白均有分布；綠、紅色熒光分別為FITC標(biāo)記的HSP70和QD655nm特異性標(biāo)記的Survivin蛋白。QD655nm紅色熒光在高強度激光連續(xù)激發(fā)40min 20s 391ms后熒光無明顯減弱,而FITC綠色熒光基本淬滅。隨著FITC的淬滅,多色通道下所見的3種顏色(黃、紅、綠)的熒光也逐漸消退直至變成單色的紅色熒光。表明量子點較FITC具有更好的光穩(wěn)定性。 第三章利用多種不同粒徑的量子點探針同時對人舌鱗癌細胞中HSP70、HSP90及p53蛋白進行多重標(biāo)記的初步探索 目的 利用三種不同粒徑量子點同時對人舌癌Tca8113細胞內(nèi)的HSP70, HSP90以及p53進行特異性多重標(biāo)記,并通過共聚焦顯微鏡觀察蛋白空間分布和相互作用等情況,初步探索同時多通道高通量實時動態(tài)檢測細胞內(nèi)多種蛋白質(zhì)分子的活動、相互作用和變化規(guī)律以及為蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)研究等提供嶄新的技術(shù)平臺。 方法 在對HSP70、HSP90蛋白雙重標(biāo)記的基礎(chǔ)上進行多重標(biāo)記 1細胞培養(yǎng)：選用人舌癌Tca8113細胞。 2細胞接種。 3首先用量子點QD525nm和QD655nm,通過雙重免疫熒光法同時對人舌癌Tca8113細胞內(nèi)HSP70、HSP90蛋白進行雙重標(biāo)記。 4在雙重標(biāo)記的基礎(chǔ)上,再用量子點QD565nm通過間接免疫熒光法,對人舌癌Tca8113細胞內(nèi)p53蛋白進行標(biāo)記,并在激光共聚焦顯微鏡下進行觀察識別。 結(jié)果 在激光共聚焦顯微鏡下觀察到舌癌細胞HSP70、Survivin和HSP90蛋白均呈高表達。多色通道下可見到5種不同顏色的熒光(黃、紅、綠、橙及暗紅),暗紅色熒光為綠、橙、紅色三種熒光重疊而形成的,主要分布于細胞核內(nèi)及核周邊,表示該區(qū)域HSP70、HSP90及p53這三種蛋白均有分布；黃色熒光為紅、綠色熒光重疊而形成,主要分布于細胞漿內(nèi),表示該區(qū)域HSP70、HSP90這兩種蛋白均有分布；綠色熒光為QD525nm標(biāo)記的HSP70,主要分布在胞漿內(nèi),胞核內(nèi)亦有分布；紅色熒光為QD655nm標(biāo)記的HSP90,主要分布在胞漿內(nèi),胞核內(nèi)少量分布。橙色熒光為QD565nm標(biāo)記的P53,主分布于核膜及其周邊,核內(nèi)也有少量分布。 第四章利用量子點探針觀測人舌鱗癌Tca8113細胞熱刺激前后HSP70動態(tài)變化的研究 目的 利用量子點探針對人舌癌Tca8113細胞內(nèi)的HSP70進行特異性熒光標(biāo)記,并通過共聚焦顯微鏡觀察分析細胞在室溫和經(jīng)43℃加熱30min后的細胞內(nèi)HSP70蛋白的動態(tài)變化及空間分布,并與FITC作比較。 方法 1.細胞培養(yǎng)：選用人舌癌Tca8113細胞。 2.細胞接種。 3.加熱處理：待細胞長滿至80%后,將實驗組轉(zhuǎn)移置水浴箱中43℃加熱30min后,37℃恒溫繼續(xù)孵育,然后分別于加熱后2h、4h、6h、8h以及10h取出,對照組直接37℃恒溫孵育取出。 4.利用量子點QD525nm通過間接免疫熒光法,對人舌癌Tca8113細胞內(nèi)HSP70蛋白進行標(biāo)記,并在激光共聚焦顯微鏡下進行觀察識別。 5.利用異硫氰酸熒光素(FITC),通過間接免疫熒光法,對人舌癌Tca8113細胞內(nèi)HSP70蛋白進行標(biāo)記,并激光共聚焦顯微鏡下進行觀察識別。 6.激光共聚焦顯微鏡觀察時的參數(shù)設(shè)置：激發(fā)光譜波長488nm,用Image-Pro Plus圖像分析軟件測量量子點QD525nm和異硫氰酸熒光素(FITC)的熒光信號強度,利用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析實驗所得數(shù)據(jù)用X±s表示,兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗。 結(jié)果 1.QD525nm標(biāo)記的實驗組肉眼即可發(fā)現(xiàn)Tca8113細胞受熱后2h細胞內(nèi)HSP70的表達就開始有明顯的升高,6h達到高峰,并且有向核內(nèi)聚集的趨勢,10h回復(fù)到加熱前的水平。然而FITC標(biāo)記的各組肉眼未能發(fā)現(xiàn)明顯的熒光強度的改變,只有4h、6h較0h組稍有增強,但變化沒有QD525nm標(biāo)記的實驗組明顯。 2.定量分析發(fā)現(xiàn)：利用QD525nm標(biāo)記的HSP70的表達量在加熱后2h就有顯著的增加(P0.05),4h則出現(xiàn)一個表達的小低谷,但熒光強度與Oh還是有顯著性差異(P0.05),6h熒光強度達到高峰,然后8h開始逐漸削弱,到了10h與0h沒有顯著性差異(P0.05),恢復(fù)到加熱前的水平。然而利用FITC標(biāo)記的HSP70的表達在加熱后4h才有顯著的增加,未發(fā)現(xiàn)有一個低谷的出現(xiàn),6h熒光強度達到高峰,然后8h開始逐漸削弱,到了10h恢復(fù)到加熱前的水平。 全文結(jié)論： 1.量子點熒光標(biāo)記技術(shù)能對口腔鱗癌細胞內(nèi)HSP70, HSP90, p53及Survivin蛋白進行特異性的標(biāo)記。 2.量子點較傳統(tǒng)的有機熒光光強度更高,特異性更好,光穩(wěn)定性更強,不易漂白或光解,適合長時間檢測。 3.量子點能同時對細胞內(nèi)的三種蛋白進行多重標(biāo)記的免疫熒光成像研究,且適合長時間的動態(tài)觀察 4.量子點能對細胞內(nèi)HSP70蛋白進行熱刺激前后的長時間的動態(tài)觀察以及定位定量分析。
【圖文】：

二結(jié)果利用量子點QD525nm對舌癌Tcas113固定細胞中的HsP70蛋白進行標(biāo)記，并與FITC標(biāo)記相比較。在激光共聚焦顯微鏡下見:QD525nm特異性標(biāo)記的HSP70在人舌癌Tca8113細胞漿、細胞核均有明顯表達，主要分布于胞漿內(nèi)，，表現(xiàn)為綠色熒光(如圖4一IA一圖4一IC)。與FITC標(biāo)記組(如圖4一ID一圖4一IE)相比較，HSP70細胞亞定位一致，但QD525nn，標(biāo)記的熒光圖效果好，背景干凈，非特異性染色很少，特異性更好，熒光強度更強(P<0.05見第二章表2一l)。

利用QD525nm對各組(未加熱組、加熱后Zh、4h、6h、sh以及zoh)進行標(biāo)記(如圖4一2)所示:肉眼即可發(fā)現(xiàn) Tcas113細胞受熱后2h細胞內(nèi)HSP70的表達就開始有明顯的升高，6h達到高峰，并且有向核內(nèi)聚集的趨勢，10h回復(fù)到加熱前的水平。而與FITC標(biāo)記的各組進行比較(如圖4一3)各實驗組肉眼未能發(fā)現(xiàn)明顯熒光強度的改變，只有4h、6h組較0h組稍有增強，但沒有QD525nm變化明顯。圖4一2Fig.4一 2Confoeal月 uoreseenceimagesHSP70進行熱刺激前后空間動態(tài)示蹤的研究 ofHSP70inhumantongueeancerTca8113ato.利用QD525nrn對日sP7o taggedbyQD525nl，12，4，6
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R739.8

【參考文獻】

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1 張春陽,馬輝,丁堯,金雷,陳瓞延,苗琦,聶書明;量子點標(biāo)記天花粉蛋白的研究[J];高等學(xué)�；瘜W(xué)學(xué)報;2001年01期

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本文編號：2707668