【摘要】：第一部分PTP4A1基因在舌鱗癌組織中的表達(dá)及臨床意義 目的：檢測(cè)肝細(xì)胞再生磷酸因子-1（protein tyrosine phosphatase typeIVA, member1, PTP4A1）在舌鱗癌中的表達(dá)情況,并分析其表達(dá)水平與舌鱗癌臨床病理參數(shù)的關(guān)系。 方法：采用免疫組織化學(xué)法（SP法）檢測(cè)15例正常舌組織、30例舌鱗癌組織石蠟包埋切片中PTP4A1的表達(dá)；對(duì)15例新鮮舌鱗癌組織進(jìn)行realtime-PCR，檢測(cè)PTP4A1mRNA在舌癌組織、癌旁組織、正常舌組織的表達(dá)。 結(jié)果：PTP4A1在舌鱗癌組織中呈陽(yáng)性和強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)，多見(jiàn)于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核內(nèi)，而在正常舌組織中呈陰性和弱陽(yáng)性表達(dá)；PTP4A1在舌鱗癌的陽(yáng)性表達(dá)率為83%，顯著高于其在正常舌組織中的表達(dá)率33.3%；PTP4A1在舌癌組織和正常舌組織的表達(dá)有顯著性差異（P0.05）；而且PTP4A1的表達(dá)水平與腫瘤的淋巴轉(zhuǎn)移相關(guān)（P0.05），而與病人的性別、年齡、腫瘤的大小、腫瘤的分期分級(jí)無(wú)明顯相關(guān)。realtime-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示舌癌組織及舌癌細(xì)胞系TCA8113細(xì)胞中的PTP4A1的mRNA表達(dá)水平高于其在癌旁和正常舌組織的表達(dá)，癌旁組織的表達(dá)高于正常舌組織的表達(dá)（P0.05）。 結(jié)論：PTP4A1基因mRNA水平和蛋白水平表達(dá)在舌癌組織中高表達(dá)，可能在舌鱗癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著一定作用。 第二部分PTP4A1基因RNAi慢病毒載體的構(gòu)建與鑒定 目的：構(gòu)建shRNA PTP4A1的慢病毒載體，并檢測(cè)其在TCA8113舌鱗癌細(xì)胞株對(duì)PTP4A1的抑制效果，且篩選出穩(wěn)定感染的細(xì)胞株。 方法：設(shè)計(jì)合成五對(duì)針對(duì)靶基因（PTP4A1mRNA）的shRNA寡核苷酸序列，分別構(gòu)建質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，根據(jù)其對(duì)293T細(xì)胞PTP4A1基因的抑制率篩選出最有效的PTP4A1基因的RNAi靶序列，設(shè)計(jì)并合成siRNA的雙鏈DNA Oligo,與含綠色熒光蛋白(GFP)編碼基因的hU6-MCS-Ubiquitin-EGFP-IRES-puromycin重組慢病毒載體siRNA-PTP4A1，共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝產(chǎn)生慢病毒，以GFP蛋白的表達(dá)水平測(cè)定病毒滴度。用realtime-PCR和western-blot檢測(cè)重組慢病毒質(zhì)粒感染TCA8113細(xì)胞后對(duì)PTP4A1基因的干擾效果。 結(jié)果：酶切電泳分析以及DNA測(cè)序證實(shí)成功構(gòu)建了PTP4A1基因RNAi慢病毒載體,獲得相應(yīng)的慢病毒，濃縮病毒懸液的滴度7.0E+8TU/ml。和對(duì)照組相比RNA干擾組TCA8113細(xì)胞PTP4A1基因的mRNA和蛋白水平的抑制率分別為55%和60%以上（P0.05）。并成功篩選出穩(wěn)定感染的舌鱗癌細(xì)胞株。 結(jié)論：構(gòu)建的重組慢病毒siRNA-PTP4A1載體能有效的抑制PTP4A1基因在舌鱗癌細(xì)胞TCA8113的表達(dá)，且成功的篩選出其穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞株，為下一步的研究打下基礎(chǔ)。 第三部分RNA干擾沉默PTP4A1基因的表達(dá)對(duì)舌鱗癌細(xì)胞TCA8113的體內(nèi)外生物學(xué)特性的影響 目的：研究沉默舌鱗癌細(xì)胞TCA8113中基因PTP4A1的表達(dá)對(duì)其體內(nèi)外生物學(xué)行為的影響及其機(jī)制的探討。 方法：分別檢測(cè)PTP4A1下調(diào)前后的舌鱗癌細(xì)胞TCA8113生物學(xué)特性的變化，MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖；流式細(xì)胞分析細(xì)胞周期和凋亡；平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)克隆形成能力；transwell小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲的影響；利用Western-blot檢測(cè)bcl-2、bax蛋白水平表達(dá)的變化，以及realtime-PCR檢測(cè)MMP2、MMP9在mRNA表達(dá)水平的變化；通過(guò)裸鼠的移植瘤模型觀察舌鱗癌細(xì)胞TCA8113下調(diào)基因PTP4A1表達(dá)后在裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)情況。 結(jié)果：下調(diào)PTP4A1的表達(dá)后，MTT結(jié)果顯示KD組細(xì)胞增殖能力小于NC、CON組；細(xì)胞凋亡率也明顯增加，，KD組早期凋亡為（17.48±0.70）%，而NC、CON組的早期細(xì)胞凋亡率為（7.34±0.70）%和（4.86±0.25）%(P0.01)；KD組細(xì)胞周期阻滯在G1/G0和S期(P0.05)；Western blot結(jié)果顯示bcl-2蛋白表達(dá)降低(P0.01)，bax蛋白表達(dá)增高(P0.01)；KD組體外克隆形成數(shù)小于NC、CON組(P0.01)；穿過(guò)人工基地膜的平均數(shù)為（35±6）明顯少于CON組（134±8.882）及NC干擾組（123±6.557），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p0.01）；沉默PTP4A1基因的表達(dá)后細(xì)胞的MMP2和MMP9在mRNA水平的表達(dá)與NC組比較分別降低為27.4%(P0.05)和35.2%(P0.05)；KD組細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)速度會(huì)變慢，最后所得瘤體的重量和體積均小于CON和NC組。 結(jié)論：下調(diào)PTP4A1的表達(dá)對(duì)舌鱗癌細(xì)胞TCA8113的體外增殖、凋亡、侵襲有明顯抑制作用，細(xì)胞周期阻滯在G0/G1和S期，其機(jī)制可能和PTP4A1下調(diào)后bcl-2、MMP-2、MMP-9表達(dá)下降，bax表達(dá)增加有關(guān)。
【圖文】：

A B.1 PTP4A1 在舌鱗癌組織（A）和正常舌組織（B）中的表達(dá)情況，400×PTP4A1 expression in human tongue squamous tissue(A) and in normal toealtime-PCR 結(jié)果圖，PTP4A1 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量情況。lts of realtime-PCR and relative PTP4A1NA expressions in different groups圖 2.1 載體圖譜Fig 2.1 the vector map1 2 3 4 5 圖 2.3 各組 FLAG 融合蛋白的表達(dá)量。1：空白2：KD2＃;3：KD1＃;4：KD4＃;5：KD3＃;6：K

圖 1.2 realtime-PCR 結(jié)果圖，PTP4A1 mRNA 的相對(duì)表達(dá)量情況。Fig1.2 Results of realtime-PCR and relative PTP4A1mRNA expressions in different groups圖 2.1 載體圖譜Fig 2.1 the vector map1 2 3 4 5 6 7 8圖 2.2 PCR 陽(yáng)性克隆圖。1:陰性對(duì)照 ddH2O；2:空載體自連對(duì)照；3:marker;4-8：PTP4A1-GV288 RNAi 轉(zhuǎn)換子鑒定Fig 2.2 the PCR result of positive clone.1：negativecontrol ddH2O；2：empty vector control；3：marker；4-8:PTP4A1-GV248 RNAi convector1 2 3 4 5 6圖 2.3 各組 FLAG 融合蛋白的表達(dá)量。1：空白載體組2：KD2＃;3：KD1＃;4：KD4＃;5：KD3＃;6：KD5＃Fig 2.3 FLAG protein expression in differentgroup.1:empty vector groups;2：KD2＃;3：KD1＃;4：KD＃;5：KD3＃;6：KD5＃圖 2.4 Chromas 測(cè)序結(jié)果：測(cè)通，ok。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R739.86

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2705418