發(fā)布時(shí)間：2020-06-09 16:13

【摘要】：目的:鳶尾素(irisin)是由骨骼肌在運(yùn)動(dòng)過后大量分泌的肌肉因子。近年來研究表明irisin除了在糖脂代謝中具有重要作用外,irisin與骨組織代謝和力學(xué)作用之間存在密切聯(lián)系。故本實(shí)驗(yàn)研究了體外條件下irisin與力學(xué)因素作用在促進(jìn)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Marrow Mesenchymal Stromal Cells,BMSCs)成骨向分化之間的作用。首先研究不同濃度irisin對(duì)大鼠BMSCs增殖及成骨標(biāo)志物表達(dá)的影響,篩選出最適irisin濃度。以篩選出的最佳irisin濃度為參考,研究此濃度的irisin對(duì)靜態(tài)及牽張力作用下大鼠BMSCs成骨向分化的影響。方法:一、分離培養(yǎng)原代大鼠BMSCs并行流式細(xì)胞鑒定。實(shí)驗(yàn)按照irisin濃度分組如下:A:0ng/mL、B:10ng/mL、C:50ng/mL、D:100ng/mL、E:500ng/mL。采用CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞0-7天的增殖情況。采用ALP(Alkaline phosphatase)染色及ALP活性實(shí)驗(yàn)來檢測(cè)各組細(xì)胞堿性磷酸酶的表達(dá)差異;定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(Quantitative reverse transcription Polymerase chain reaction,qRT-PCR)檢測(cè)各組細(xì)胞成骨相關(guān)標(biāo)志物:ALP、Runx2(成骨核心轉(zhuǎn)錄因子)、OPN(Osteopontin,骨橋蛋白)mRNA表達(dá);Western Blot檢測(cè)成骨標(biāo)志物:Runx2蛋白的表達(dá)。二、取第3代大鼠BMSCs,應(yīng)用四點(diǎn)彎曲細(xì)胞加力儀建立體外細(xì)胞牽張模型。依據(jù)篩選出的最適irisin濃度。實(shí)驗(yàn)分組如下:(A)對(duì)照組、(B)irisin組(100ng/mL irisin)、(C)牽張力組(2000με牽張力)、(D)irisin+牽張力組(100ng/mL irisin+2000με牽張力)。細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)在靜態(tài)及牽張力作用下,各組細(xì)胞增殖情況;ALP染色、茜素紅染色檢測(cè)各組細(xì)胞成骨向分化早期及晚期的差異,通過定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(qRT-PCR)及Western Blot檢測(cè)成骨相關(guān)mRNA及蛋白的表達(dá),并檢測(cè)P38、ERK1/2MAPK信號(hào)通路的表達(dá)情況。對(duì)所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),嚴(yán)格進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果:一、CCK-8檢測(cè)結(jié)果示:10-100ng/mL濃度范圍irisin可促進(jìn)大鼠BMSCs增殖(P0.05),其中100ng/mL irisin促進(jìn)大鼠BMSCs增殖作用最顯著(P0.01)。ALP染色及ALP活性檢測(cè)結(jié)果、qRT-PCR及Western Blot結(jié)果進(jìn)一步證實(shí):irisin可促進(jìn)ALP、OPN、Runx2 mRNA及蛋白表達(dá),100ng/mL的irisin可能為促進(jìn)大鼠BMSCs成骨向分化的最佳濃度。二、細(xì)胞增殖檢測(cè)結(jié)果示:與對(duì)照組相比,irisin+牽張力組可促進(jìn)大鼠BMSCs的增殖(P0.05)。ALP及茜素紅染色結(jié)果均顯示irisin+牽張力組促進(jìn)大鼠BMSCs成骨效果均顯著高于其他組。qRT-PCR結(jié)果示:irisin+牽張力可促進(jìn)成骨標(biāo)志物Runx2、ALP、COL-Ⅰ、OPN表達(dá)的升高(P0.05)。Western Blot結(jié)果示:irisin+牽張力可促進(jìn)Runx2蛋白表達(dá)的升高(P0.05)。此外,irisin+牽張力聯(lián)合作用促進(jìn)大鼠BMSCs增殖與成骨向分化的機(jī)制可能與P38、ERK1/2 MAPK通路的激活有關(guān)。結(jié)論:irisin可促進(jìn)大鼠BMSCs增殖及成骨向分化,irisin濃度為100ng/mL時(shí)可能為促進(jìn)大鼠BMSCs增殖、成骨向分化的最佳濃度。irisin對(duì)靜態(tài)和體外牽張力作用下大鼠BMSCs增殖及成骨向分化具有促進(jìn)作用,此效應(yīng)可能通過P38、ERK1/2 MAPK通路發(fā)揮作用。
【圖文】：

原代（P0）大鼠 BMSCs 第 3 代(P3)大鼠 BMSCs圖 1.1. SD 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞鏡下照片F(xiàn)igure 1.1 .Photograph of SD rat bone marrow mesenchymal stem cells：Primary (P0) ratBMSCs and Third generation (P3) rat BMSCs.圖 1.2. 流式細(xì)胞鑒定結(jié)果Figure1. 2. Flow cytometry results:CD29 expression rate: 99.87%, CD44 expression rate:90.78%, CD45 expression rate: 0.25%.

達(dá)率:90.78%,白細(xì)胞標(biāo)志抗原CD45表達(dá)率:0.25%,此表面抗原鑒定結(jié)果符合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志物特征。原代（P0）大鼠 BMSCs 第 3 代(P3)大鼠 BMSCs圖 1.1. SD 大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞鏡下照片F(xiàn)igure 1.1 .Photograph of SD rat bone marrow mesenchymal stem cells：Primary (P0) ratBMSCs and Third generation (P3) rat BMSCs.
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R782.4

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