【摘要】： 目的： 牙齒美白技術已經(jīng)有一百多年的歷史,隨著審美水平的不斷提高,牙齒美白日益受到人們的青睞。雖然漂白劑已經(jīng)有了較多改進,但是其主要成分始終是高濃度的過氧化氫(hydrogen peroxide, H2O2),通過H202分解、形成大量的超氧化物自由基而發(fā)揮漂白作用,近年來,為更快達到漂白效果,漂白劑的濃度有增高趨勢,其安全性一直受到人們的關注。如漂白后的牙齒出現(xiàn)不同程度的過敏癥狀。研究證實,H2O2具有細胞毒性,引起人牙齦成纖維細胞還原型谷胱甘肽減少,對細胞形態(tài)學和活性有顯著影響。H2O2和過氧化脲能夠滲透牙釉質和牙本質并進入髓腔,髓腔內(nèi)的酶類明顯被抑制,但沒有造成不可逆性損傷。H2O2能否引起人牙髓細胞氧化還原狀態(tài)的變化尚未見報告。 因此,本研究以體外培養(yǎng)的人牙髓細胞氧為研究對象,以人牙髓細胞內(nèi)氧化型、還原型谷胱甘肽和氧化型、還原型輔酶Ⅱ的含量為指標,同時檢測H2O2對人牙髓細胞活性和形態(tài)學的影響,從而可能為評估H2O2的安全性提供新方法,為漂白過程中采用低濃度的漂白劑和采取防護措施提供理論依據(jù)。 方法： 1、本研究采用組織塊酶消化法培養(yǎng)人牙髓細胞；使用免疫細胞化學法對所培養(yǎng)細胞進行鑒定；使用550酶標儀測定其吸光度(A)值；使用蘇木素-伊紅染色法對人牙髓細胞進行染色并觀察其形態(tài)學變化。 2、使用高效液相色譜法檢測H2O2作用后人牙髓細胞內(nèi)GSH和SSSG的含量,并進一步得出GSSG/GSH的比值。 3使用分光光度法檢測H2O2作用后人牙髓細胞內(nèi)NADPH和NADP+的含量,并進一步得出NADP+/NADPH的比值。 結果： 1、人牙髓細胞的培養(yǎng)及H2O2對人牙髓細胞活性和形態(tài)學的影響 本實驗采用組織塊酶消化法成功培養(yǎng)出人牙髓細胞并順利傳代。經(jīng)免疫細胞化學鑒定,提示細胞為間葉組織來源。 將人牙髓細胞種于96孔板,分組處理后加入10 ul CCK-8試劑,550酶標儀在450 nm波長下測定吸光度(A)值。隨著H2O2濃度增高,特別是0.4 mM H2O2組,作用時間延長,人牙髓細胞活性顯著下降。 將人牙髓細胞種于24孔板,分組處理后進行蘇木素-伊紅染色(HE染色)。0.1 mM H2O2作用1-2h,光鏡下未見細胞形態(tài)有明顯變化,4h時,光鏡下見細胞體積稍變小,細胞之間出現(xiàn)小間隙。0.2-0.4 mM H2O2作用1-4 h,光鏡下見細胞體積變小變圓,有的形成囊泡,細胞膜失去完整性,細胞之間失去正常的連接,有的細胞發(fā)生溶解,并隨濃度和作用時間的延長而愈加明顯。特別是0.4mM H2O2組,人牙髓細胞體積萎縮,細胞核與細胞質比例失調(diào),大部分細胞膜裂解,細胞死亡,細胞數(shù)量顯著減少。 2、H2O2對人牙髓細胞內(nèi)GSH、GSSG及GSSG/GSH的影響 0.1 mMH2O2組,GSH濃度隨作用時間延長而降低,GSSG隨作用時間延長而升高，GSSG/GSH隨作用時間延長而升高。0.2 mM和0.4 mM H2O2組,GSH和GSSG濃度隨作用時間延長而降低,GSSG/GSH隨作用時間延長而升高,提示人牙髓細胞的的氧化還原狀態(tài)向氧化方向偏移,但是0.4 mM H2O2作用時間為4 h時,樣本中沒有檢測到GSH和GSSG。 3、H2O2對人牙髓細胞內(nèi)NADPH、NADP+及NADP+/NADPH的影響 0.1 mM H2O2組,NADPH濃度隨作用時間延長而降低,NADP+隨作用時間延長而升高,NADP+/NADPH隨作用時間延長而升高。0.2 mM和0.4 mM H2O2組,NADPH和NADP+濃度隨作用時間延長而降低,NADP+/NADPH隨作用時間延長而升高,提示人牙髓細胞的的氧化還原狀態(tài)向氧化方向偏移,但是0.4 mM H2O2作用時間為4 h時,樣本中沒有檢測到GSH和GSSG。 結論： 1、組織塊酶消化法是培養(yǎng)原代人牙髓細胞的理想方法之一,H2O2降低人牙髓細胞的活性并能夠改變細胞的形態(tài)。 2、隨H2O2濃度的增高和作用時間延長,人牙髓細胞的的氧化還原狀態(tài)向氧化方向偏移。
【圖文】：

組織塊貼壁2一sd后倒置顯微鏡下可見到少量單個梭形的貼壁細胞，1周后可見貼壁組織塊周圍有細胞向外游出，隨著培養(yǎng)時間的延長游出的細胞逐漸增多，圍繞在組織塊周圍呈放射狀向外生長(圖2.1.1)，細胞達到70%一80%融合時可將細胞進行消化、傳代。傳代后細胞可迅速貼壁且分布較為均勻，細胞多為梭形。傳代培養(yǎng)3d細胞形態(tài)多為飽滿的長梭形或扁平狀的成纖維樣細胞，折光度好，核仁明顯。傳代培養(yǎng)sd后細胞形態(tài)大多為細長成纖維細胞，呈平行排列生長或旋渦狀生長，細胞由單層逐漸變?yōu)槎鄬樱伤缮⒆優(yōu)榫o密(圖2.1.2)，當細胞鋪滿瓶底時進行細胞傳代。圖2.1.1原代培養(yǎng)的人牙髓細胞(10Ox)圖2.1.2第三代人牙髓細胞(100x)2.2人牙髓細胞組織來源鑒定人牙髓細胞的細胞漿中波形絲蛋白呈陽性表達

傳代培養(yǎng)3d細胞形態(tài)多為飽滿的長梭形或扁平狀的成纖維樣細胞，折光度好，核仁明顯。傳代培養(yǎng)sd后細胞形態(tài)大多為細長成纖維細胞，呈平行排列生長或旋渦狀生長，細胞由單層逐漸變?yōu)槎鄬�，由松散變�(yōu)榫o密(圖2.1.2)，當細胞鋪滿瓶底時進行細胞傳代。圖2.1.1原代培養(yǎng)的人牙髓細胞(10Ox)圖2.1.2第三代人牙髓細胞(100x)2.2人牙髓細胞組織來源鑒定人牙髓細胞的細胞漿中波形絲蛋白呈陽性表達，胞漿呈棕黃色，胞核無著色(圖2.2.1)，角蛋白呈陰性表達，胞漿無著色，細胞核呈藍色(圖2.2.2)，提示細胞為間葉組織來源。
【學位授予單位】：鄭州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2010
【分類號】：R783

【參考文獻】

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本文編號：2704220