發(fā)布時(shí)間：2020-06-08 00:58

【摘要】： 目的比較骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bone marrow stromal cells, BMSCs)和牙周韌帶細(xì)胞(periodontal ligament cells, PDLCs)促進(jìn)牙周組織再生的能力,為牙周組織的再生治療提供依據(jù)。 方法1.體外觀察α-MEM、DMEM-LG和RPMI 1640三種培養(yǎng)基對(duì)Beagle犬BMSCs增殖與分化的影響。2.體外觀察脫細(xì)胞真皮基質(zhì)(acellular dermal matrix, ADM)與BMSCs生物相容性;并將ADM作為成骨誘導(dǎo)后BMSCs的載體,植入裸鼠皮下,單純的ADM作為對(duì)照組,分別于術(shù)后4W和8W觀察大體標(biāo)本及組織學(xué)情況。3.體外通過實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction, Realtime PCR)、免疫細(xì)胞化學(xué)染色、Von Kossa染色等方法比較BMSCs和PDLCs再生組織的能力。4.將雄性裸鼠12只隨機(jī)分兩組,每組6只,于每只皮下植入ADM、BMSCs+ADM、PDLCs+ADM。4W和8W后分別處死一組取標(biāo)本,常規(guī)固定、脫鈣、包埋、切片后進(jìn)行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin, HE)染色、Gomori特殊染色和免疫組化染色,以比較BMSCs和PDLCs再生組織的潛能。 結(jié)果1.α-MEM組24h內(nèi)貼壁的細(xì)胞數(shù)目最多;消除貼壁差異后,α-MEM和DMEM促增殖作用相近;α-MEM組堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)表達(dá)量最高,但礦化結(jié)節(jié)形成數(shù)目較少,DMEM組礦化結(jié)節(jié)形成個(gè)數(shù)最多。2.體外培養(yǎng)觀察BMSCs與ADM有良好的生物相容性;實(shí)驗(yàn)組4W,ADM部分降解吸收,BMSCs在其中生長良好,出現(xiàn)新生組織,部分出現(xiàn)類骨樣結(jié)構(gòu);8W,ADM大部分吸收,形成大量的新生組織和類骨樣結(jié)構(gòu);單純ADM組新生組織形成較少,支架材料降解速度與實(shí)驗(yàn)組類似。3. Realtime PCR檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)PDLCs中膠原Ⅻ和骨保護(hù)素(osteoprotegerin, OPG)表達(dá)量都高于BMSCs(P0.05),ALP表達(dá)含量在二者之間差異無顯著性(P0.05);細(xì)胞免疫組化染色顯示PDLCs中膠原Ⅻ表達(dá)的量高于BMSCs(P0.05),而OPG染色、ALP活性檢測及Von Kossa染色結(jié)果都表明BMSCs成骨能力高于PDLCs。4. 4W和8W組織學(xué)觀察和免疫組化染色顯示BMSCs形成類骨樣結(jié)構(gòu)多于PDLCs,而牙周韌帶形成能力仍小于PDLCs。 結(jié)論1.培養(yǎng)基α-MEM促進(jìn)BMSCs的增殖,但促礦化能力較弱;DMEM-LG培養(yǎng)基促進(jìn)細(xì)胞增殖和分化,較適合BMSCs的培養(yǎng)。2. ADM可為細(xì)胞的生長和分化提供理想的三維空間,并具有作為牙周組織工程支架材料的潛力,在組織工程化牙周膜的構(gòu)建中有良好的應(yīng)用前景。3.體內(nèi)外研究表明BMSCs成骨能力高于PDLCs,但其形成牙周韌帶的能力低于PDLCs。
【圖文】：

圖 1-1 BMSCs 獲取流程圖2. 貼壁狀況取 P6代細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為 2.5×104/mL，每孔 200μL，接種到 96 孔別在 2h7h10h24h，MTT 法測定 A492。3. 細(xì)胞增殖3.1 MTT 法檢測取 P4代細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為 1.0×104/mL，每孔 200μL，接種到 96 孔用其中一種培養(yǎng)基接種 24h 后，消除貼壁差異，，再分別更換不同培養(yǎng)基進(jìn)MTT 法測定接種后 1-7d 的 A492，結(jié)果取平均值。其余兩組檢測方法同上。3.2 集落形成取 P4代細(xì)胞，以 1.0×105/mL 接種至 100mm 培養(yǎng)皿，分別用 DMEMRα-MEM 培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，1w 后結(jié)晶紫染色觀察集落形成情況。3.3 細(xì)胞周期

4.2 Von Kossa 染色選取 P3代細(xì)胞，以 5.0×104/孔接種 24 孔板，每組 6 孔，每隔 3d 換液，連續(xù)培養(yǎng)至出現(xiàn)肉眼可見的白色結(jié)節(jié)，作 Von Kossa 染色，在倒置顯微鏡下觀察礦化結(jié)節(jié)染色情況。5. 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法應(yīng)用 SPSS 13.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，對(duì) ALP 活性貼壁狀況檢測結(jié)果采用單因素方差分析，以 P<0.05 為顯著性標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果1．細(xì)胞培養(yǎng)觀察接種后，皿底沉淀有大量血細(xì)胞，無法觀察到細(xì)胞貼壁情況。5d 全量換液，可見大部分細(xì)胞呈梭形，少數(shù)呈現(xiàn)圓形或多角形，α-MEM 組細(xì)胞與其它兩組相比數(shù)量較多（圖 1-2）。DMEM 和 RPMI 1640 組培養(yǎng) 10-12d 可達(dá) 90%融合，即可進(jìn)行消化傳代。α-MEM 組約 7d，若此時(shí)未及時(shí)傳代，易覆層生長，形成膜狀物漂浮于培養(yǎng)基中。
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R781.4

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本文編號(hào)：2702270