目的:本研究通過(guò)提取非綜合征性唇腭裂患者及正常人的血漿外泌體,并對(duì)外泌體的濃度進(jìn)行測(cè)量分析,探討血漿中外泌體濃度與唇腭裂發(fā)生之間的關(guān)系。進(jìn)一步抽提外泌體中miRNA,運(yùn)用miRNA測(cè)序篩選出非綜合征性唇腭裂患兒血漿外泌體中異常表達(dá)的miRNA,并進(jìn)行生物信息學(xué)分析,預(yù)測(cè)其參與的生物學(xué)過(guò)程及信號(hào)通路。方法:收集8例非綜合征性唇腭裂患兒以及性別年齡與之相匹配的8名健康兒童的外周血10ml,通過(guò)離心分離血漿,利用QIAGEN exoEasy Maxi Kit試劑盒,使用超濾法提取血漿中的外泌體;在透射電鏡下觀察外泌體的形態(tài)、測(cè)量其大小,并計(jì)數(shù),BCA法測(cè)定外泌體蛋白濃度,并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。另采用Trizol法提取外泌體中的miRNA,構(gòu)建miRNA文庫(kù),用Agilent2100 miRNA微陣列芯片分析,篩選顯著差異表達(dá)的miRNA,預(yù)測(cè)其相應(yīng)的靶基因,并進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路富集分析。結(jié)果:第一部分:本研究成功從16例血漿樣本中分離外泌體,透射電鏡下觀察到30-100nm大小不一的囊泡狀結(jié)構(gòu),符合外泌體的電鏡表現(xiàn),在透射電鏡相鄰的四個(gè)視野下,測(cè)得外泌體總數(shù)量47,最小直徑為40nm,...

【文章頁(yè)數(shù)】：97 頁(yè)

【學(xué)位級(jí)別】：碩士

【部分圖文】：

圖1.外泌體分離流程

圖1.外泌體分離流程定——電鏡觀察樣品10μl加于200目銅網(wǎng)上沉淀10分鐘，濾紙吸去浮鈾10μl滴加于銅網(wǎng)上沉淀1分鐘，濾紙吸去浮液；分鐘；成像。度測(cè)定方法和工作液的制備制備要求制作一組蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品表1.系列稀釋牛血清白蛋白（BSA）標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液體積....

圖2.標(biāo)準(zhǔn)曲線

所有EP管冷卻至室溫。.4蛋白濃度測(cè)定。利用BCA蛋白定量法對(duì)外泌體的濃度進(jìn)行測(cè)定[16]。在Nanodrop2100BCA測(cè)定，參照標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2），讀取各樣品的蛋白濃度。

圖3.1透射電鏡下外泌體形態(tài)觀察

符合外泌體的電鏡表現(xiàn)，且可觀察到其典型的茶托狀形態(tài)（圖3.1）。圖3.1透射電鏡下外泌體形態(tài)觀察2.2AutomatedCapillaryWesternBlot結(jié)果檢測(cè)外泌體標(biāo)記蛋白TGS101、CD81的表達(dá)情況，見(jiàn)圖3.2，非綜合征性唇腭裂患者和正常對(duì)照者的....

圖3.2外泌體WES膠圖A：正常對(duì)照者B：NSCL/P患者

WesternBlot結(jié)果白TGS101、CD81的表達(dá)情況，見(jiàn)圖3外泌體中均表達(dá)TSG101和CD81。

本文編號(hào)：4005712