【摘要】： 目的 慢性牙周炎是一種以牙周微生物為始動因子,宿主免疫防御反應參與的多因素的慢性破壞性炎癥性疾病。在牙周微生物中,牙齦卟啉單胞菌(Porphyromonasgingivalis,P.gingivalis)是證據(jù)充分的牙周可疑致病菌,該菌具有多種毒力因子,如菌毛、牙齦素等,可促進P.gingivalis粘附和侵入上皮細胞,導致上皮組織的直接破壞;同時,上皮細胞在P.gingivalis及其產(chǎn)物的刺激下,細胞內若干信號通路被激活,引起細胞的免疫炎癥反應,促進了牙周炎癥的發(fā)生發(fā)展。P.gingivalis及其產(chǎn)物與上皮細胞之間的相互作用一直是牙周病學研究領域的熱點之一。 本實驗應用Western blot法檢測P.gingivalis ATCC 33277及其fimA缺陷突變株對牙齦上皮細胞的焦點粘附成分——焦點粘附蛋白Paxillin和焦點粘附激酶(focal adhesion kinase,FAK)蛋白表達的影響,探討菌毛的致病作用,進一步研究P.gingivalis對牙周組織的破壞機制,從而豐富和完善牙周病病因學理論;采用酶聯(lián)免疫吸附試驗和實時逆轉錄聚合酶鏈反應檢測P.gingivalis膜泡誘導下牙齦上皮細胞前列腺素E_2(prostaglandin E_2,PGE_2)的蛋白分泌及環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2),白細胞介素(interleukin,IL)-6和-8及基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMP)-1和-3的mRNA表達水平,從而考察牙齦上皮細胞對P.gingivalis膜泡刺激的免疫炎癥反應,建立細胞炎癥反應模型,旨在揭示P.gingivalis的致病機理,并為闡述牙齦上皮細胞在局部免疫反應中的作用提供證據(jù);同時,檢測蛇麻子多酚(hop bract polyphenol,HBP),蘋果多酚(apple condensedpolyphenol,ACT)和綠茶多酚(epigallocatechin gallate,EGCg)對P.gingivalis膜泡誘導的細胞炎癥反應的作用,試圖尋找一種新的牙周炎癥抑制劑,為牙周炎的預防和治療提供新的思路。 材料與方法 一、實驗材料 1、菌株、細胞和主要試劑 P.gingivalis ATCC 33277野生株和fimA缺陷突變株(日本大阪大學齒學部中央實驗室提供) 永生化人類牙齦上皮細胞(日本大阪大學大學院齒學部牙周病學科Murakami教授惠贈) 角化細胞特異性培養(yǎng)液(HuMedia KG2,Kurabo,Osaka,Japan) DMEM(Sigma Chemicals,St.Louis,MO) Paxillin和FAK單克隆抗體(Transduction Laboratories,Lexington,KY) ECL Plus Western blotting檢測試劑盒(Amersham Biosciences,UK) PGE_2免疫檢測試劑盒(RD Systems,Abingdon,UK) TRIzol(Invitrogen,Carlsbad,CA) 逆轉錄試劑盒(Invitrogen,Carlsbad,CA) SYBRGreen試劑(QIAGEN,Hilden,Germany) 2、主要儀器設備 超低溫冰箱(Sanyo,UltraLow,Japan) 厭氧培養(yǎng)箱(PLAS-LABS,USA) CO_2培養(yǎng)箱(Heraeus,Germany) 電泳儀以及Western blot全套專用設備(BIORAD,USA) 熱循環(huán)儀LightCycler 2(Roche Molecular Biochemicals,Mannheim,Germany) HBP(Fundamental Research Laboratory,Asahi Breweries Ltd,Japan) ACT(Fundamental Research Laboratory,Asahi Breweries Ltd,Japan) EGCg(Ftmakoshi Co.,Tokyo,Japan) 二、實驗方法 1、細菌培養(yǎng):將P.gingivalis ATCC 33277野生株和fimA缺陷突變株培養(yǎng)于含有酵母浸出物和氯化血紅素的胰酶大豆肉湯培養(yǎng)基(trypsinase soy broth,TSB)中厭氧培養(yǎng)達到對數(shù)期。 2、膜泡的分離提取:經(jīng)離心和過濾去除P.gingivalis ATCC 33277培養(yǎng)液中的菌體,上清液進行超速離心(100,000×g,1h,4℃),以500μl磷酸緩沖液溶解沉淀,即獲得牙齦卟啉單胞菌膜泡(vesicles)。用BCA蛋白檢測試劑盒檢測膜泡溶液的蛋白含量,調整濃度為1mg/ml,-80℃凍存?zhèn)溆谩?3、細胞培養(yǎng):永生化人類牙齦上皮細胞(immortalized human gingival epithelialcells,IHGE細胞)培養(yǎng)于角化細胞特異性培養(yǎng)液(HuMedia KG2)中,Hela細胞培養(yǎng)于DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium)中,加入10%胎牛血清(fetal calfserum,FCS),在飽和濕度的環(huán)境中(95%O_2,5%CO_2,37℃)培養(yǎng)。 4、多酚的預備:HBP,ACT和EGCg以二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)溶解,使DMSO在實驗中的終濃度為0.05%(v/v)。 5、Western blot檢測Paxillin和FAK的表達:IHGE細胞和Hela細胞以DMEM(含10%FCS)培養(yǎng)于6孔板中至亞融合。向培養(yǎng)液中加入P.gingivalis ATCC33277野生株及其fimA基因缺陷突變株,使感染復數(shù)(multiplicity of infection,MOI)分別為0,50,200,500。分別在感染后0,30,60,120min時以Triton-裂解緩沖液處理細胞,收集細胞裂解液。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis,SDS-PAGE)后,電轉印于聚偏氟乙烯(Polyvinylidene Fluoride,PVDF)膜上。先后與Paxillin或FAK一次抗體及辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標記的二次抗體雜交后,顯影成像。 6、酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測P.gingivalis膜泡誘導的PGE_2分泌:IHGE細胞以HuMedia KG2細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)于96孔板中至亞融合。實驗前將P.gingivalis膜泡以DMEM稀釋,使膜泡終濃度為25μg/ml和50μg/ml。將細胞培養(yǎng)于含有或不含有膜泡的DMEM中,6h和24h后,以ELISA試劑盒檢測上清液中PGE_2含量。 7、實時逆轉錄聚合酶鏈反應(real-time reverse transcription-polymerase chainreaction,real-time RT-PCR)定量檢測P.gingivalis膜泡誘導的前炎癥mRNA的表達水平:IHGE細胞以HuMedia KG2培養(yǎng)液培養(yǎng)于6孔板中至40%融合,繼而以DMEM孵育24h至亞融合。向培養(yǎng)液中加入P.gingivalis膜泡并使其終濃度達到50μg/ml,分別在0,1,3,6,9,12和24h以TRIzol處理單層細胞,提取總RNA。使用熱循環(huán)儀和SYBRGreen試劑將COX-2,IL-6,IL-8,MMP-1和MMP-3mRNA表達水平定量。 8、ELISA檢測HBP,ACT和EGCg對PGE_2的影響:以DMEM稀釋HBP,ACT和EGCg,使此三種多酚的終濃度為1,10,25μg/ml三個濃度梯度。將細胞培養(yǎng)于含有或不含有50μg/ml P.gingivalis膜泡及HBP,ACT和EGCg的DMEM中,24h后,以ELISA試劑盒檢測上清液中PGE_2含量。 9、Real-time RT-PCR法檢測HBP,ACT和EGCg對前炎癥mRNA表達水平的影響:向培養(yǎng)液中加入P.gingivalis膜泡使其終濃度達到50μg/ml,同時加入EGCg,HBP和ACT使其終濃度為1,10,25μg/ml。6h后,以TRIzol處理單層細胞,提取總RNA。使用熱循環(huán)儀和SYBRGreen試劑將COX-2,IL-6,IL-8,MMP-1和MMP-3 mRNA表達水平定量。 三、統(tǒng)計學分析 所有的數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差(SD)來表示,使用非配對t-檢驗進行比較分析,P＜0.05時數(shù)據(jù)的差異具有顯著性。 結果 1、P.gingivalis對Paxillin和FAK的降解作用 P.gingivalis ATCC 33277野生株和fimA缺陷突變株能夠使IHGE細胞和HeLa細胞的Paxillin和FAK發(fā)生降解,其fimA缺陷突變株對Paxillin和FAK的降解能力較野生株顯著減弱。 2、P.gingivalis膜泡誘導的牙齦上皮細胞炎癥反應 (1)以P.gingivalis膜泡(10,50μg/ml)刺激IHGE細胞,分別于6h和24h,ELISA檢測PGE_2的分泌水平。結果表明,于24h P.gingivalis膜泡(10,50μg/ml)顯著性濃度依賴性地促進牙齦上皮細胞PGE_2的分泌。 (2)以P.gingivalis膜泡(50μg/ml)刺激IHGE細胞,分別在0,1,3,6,9,12和24h以Real-time RT-PCR法檢測IHGE細胞的COX-2,IL-6,IL-8,MMP-1和MMP-3mRNA的表達水平。P.gingivalis膜泡顯著性促進牙齦上皮細胞COX-2,IL-6,IL-8,MMP-1和MMP-3 mRNA的表達水平。 3、HBP,ACT和EGCg對P.gingivalis膜泡誘導的牙齦上皮細胞炎癥反應的作用 (1)HBP,ACT和EGCg對P.gingivalis膜泡誘導的PGE_2的影響:HBP在所有被測濃度(1,10,25μg/ml)均顯著性抑制了IHGE細胞的PGE_2分泌,呈濃度依賴性;EGCg僅在10,25μg/ml具有抑制PGE_2分泌的作用;而ACT對PGE_2的分泌無抑制作用。 (2)HBP,ACT和EGCg對P.gingivalis膜泡誘導的COX-2,IL-6,IL-8,MMP-1和MMP-3 mRNA表達水平的影響:HBP在10,25μg/ml顯著性抑制COX-2,IL-6,IL-8的mRNA表達水平,在25μg/ml顯著性抑制MMP-1和MMP-3 mRNA表達;EGCg僅在10,25μg/ml能夠顯著性抑制COX-2的mRNA表達,對IL-6,IL-8,MMP-1和MMP-3的mRNA表達無抑制作用;而ACT則對上述被測mRNA的表達均無抑制作用。 結論 1、P.gingivalis能夠使牙齦上皮細胞的焦點粘附成分Paxillin和FAK發(fā)生降解,菌毛介導的粘附和侵入可能對焦點粘附成分的降解起著促進作用。IHGE細胞較Hela細胞對P.gingivalis的反應更靈敏,更適用于牙周致病菌的研究。2、P.gingivalis及其產(chǎn)物與牙齦上皮細胞之間的相互作用是該菌感染牙周組織的起始和關鍵,除了該菌的直接破壞作用外,P.gingivalis膜泡可顯著性誘導牙齦上皮細胞的細胞炎癥反應,促進前炎癥介質的分泌和mRNA表達,過度的免疫炎癥反應可能是牙周炎發(fā)生發(fā)展的主要原因。 3、HBP對P.gingivalis引起的牙齦上皮細胞炎癥反應具有顯著的抑制作用,具有成為牙周炎癥抑制劑的潛能,為牙周炎的預防和治療提供了新的思路。
【圖文】：

CW乙W乙W乙P袱illin圖1， westemblot法檢測 pgingivalisATcC33277野生株和fimA缺陷突變株對IHGE細胞Paxillin蛋白表達水平的影響。A:MOI為200時，pgl’ngl’ valisATCC33277野生株及其filnA缺陷突變株均能夠使IHGE細胞的Paxillin顯著降解，在相同感染時間，filnA缺陷突變株對Paxillin的降解能力較野生株顯著減弱。B:感染后60min， pgingivofisATCc33277野生株和fimA缺陷突變株對Paxiliin的降解程度隨著MOI的增加而增大;Mol相同的情況下，fimA缺陷突變株對Paxillin的降解能力較野生株顯著減弱。c:對照組(無感染 );w:p91從蘿 valisATCc33277野生株;乙:pg動 lgivalisATCC 33277fimA缺陷突變株;MOI:感染復數(shù);Paxiliin分子量 :68kDa。

里紛..一-一一IKO人MF圖2， Westemblot法檢測 pgingivalisATCC33277野生株和fin1A缺陷突變株對IHGE細胞FAK蛋白表達水平的影響。A:Mol為200時， pgingivalisATCC33277野生株及其fimA缺陷突變株均能夠使IHGE細胞的隊K發(fā)生降解，在相同感染時間，fimA缺陷突變株對Paxiliin的降解能力較野生株顯著減弱。B:感染后60min，， pgingivalisATCC33277野生株和6mA缺陷突變株對FAK的降解程度隨著MOI的增加而增大;MOI相同的情況下，五mA缺陷突變株對FAK的降解能力較野生株顯著減弱。C:對照組(無感染 );w:pgingivalisATCC33277野生株;乙:尸 gingivalisATCC 33277fimA缺陷突變株;Mol:感染復數(shù);FAK分子量 :125kDao
【學位授予單位】：中國醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2008
【分類號】：R781.4

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本文編號：2702213