【摘要】： 背景: 齲病是一種慢性非傳染性疾病,是人類的常見病及多發(fā)病之一,嚴(yán)重影響著人們的健康。齲病是在以細(xì)菌為主的多因素影響下,牙體硬組織發(fā)生慢性進(jìn)行性破壞的一種疾病,細(xì)菌是齲病發(fā)生的最關(guān)鍵因素,其中變形鏈球菌(S.mutans)血清c型和遠(yuǎn)緣鏈球菌(S.sobrinus)血清g型是與人類齲病密切相關(guān)的重要致齲菌。葡糖基轉(zhuǎn)移酶(GTF)在口腔細(xì)菌粘附和牙菌斑形成的過程中起重要作用,是變形鏈球菌群致齲的主要毒力因子之一,是細(xì)菌致齲的必備條件和物質(zhì)基礎(chǔ)。 目前齲病的防治研究主要圍繞鏈球菌在牙面的粘附、聚集及增殖等幾個環(huán)節(jié)進(jìn)行,其中細(xì)菌增殖方面的防齲研究主要集中在抗菌制劑抑制細(xì)菌生長方面,葡糖基轉(zhuǎn)移酶在細(xì)菌粘附方面起重要作用。國內(nèi)外已經(jīng)有大量有關(guān)防齲藥物的研究。其中氟的防齲效果已經(jīng)得到研究證實,但是氟化物的廣泛應(yīng)用,使其產(chǎn)生一些致齲的耐氟菌株,增加了防齲難度。因此尋求新的安全有效的防齲藥物成為研究的熱點。 蜂膠(propolis)是一種具有粘性和芳香性的固體膠狀物質(zhì),具有廣泛的生物學(xué)活性和藥理學(xué)作用,有研究已證實蜂膠對口腔常見致病1菌有較強的抑制作用。盡管國內(nèi)外對蜂膠做了大量的研究,但是目前還沒有關(guān)于蜂膠對主要致齲鏈球菌耐氟菌株的生長抑制作用及對GTF酶活性影響等相關(guān)的研究報道;且蜂膠來源、產(chǎn)地及提取工藝不同,在其成分及抗菌活性上會有所差別。因此本實驗選擇了國產(chǎn)水溶性蜂膠,測定國產(chǎn)水溶性蜂膠對變形鏈球菌、遠(yuǎn)緣鏈球菌耐氟菌株與親代菌株的生長抑制作用、葡糖基轉(zhuǎn)移酶的活性影響。 目的: 本研究將借鑒國內(nèi)、外研究成果,測定國產(chǎn)水溶性蜂膠對主要致齲鏈球菌親代菌株及其耐氟菌株的生長抑制作用、葡糖基轉(zhuǎn)移酶(GTF)活性的影響,進(jìn)一步證實蜂膠作為天然藥物防齲的有效性,并為國產(chǎn)蜂膠的開發(fā)利用提供一定的理論依據(jù)。 材料與方法: 1.氟化鈉最小抑菌濃度(MIC)遞增法體外誘導(dǎo)耐氟菌株。 將凍干保存的菌種變形鏈球菌(S.m)和遠(yuǎn)緣鏈球菌(S.s)接種于BHI血瓊脂培養(yǎng)基中,37℃微需氧活化培養(yǎng)48h(900ml/L N2,100 ml/L CO2),經(jīng)革蘭染色鏡檢及生化鑒定為變形鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌純培養(yǎng)后,采用液體稀釋法測定對氟化鈉的敏感性。 取S.m和S.s單菌落接種于TSA上37℃微需氧活化培養(yǎng)48h,刮取菌苔涂布于含NaF的TSA上,其氟化鈉含量分別為600、650、700、750、800、850、900、950、1000mg/L(S.m);300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000mg/L(S.s),逐步誘導(dǎo)產(chǎn)生耐氟菌株。將其在不含NaF的TSA上連續(xù)傳代20次后,再接種于含1000 mg/L NaF的TSA上37℃培養(yǎng),產(chǎn)生S. m和S.s耐氟菌株(S.m-FR、S.s-FR)。進(jìn)行革蘭染色鏡檢及生化鑒定后,冷凍保存。 2.蜂膠對變形鏈球菌、遠(yuǎn)緣鏈球菌及其耐氟菌株的體外抑菌實驗。 將過濾除菌的100g/L的蜂膠溶液配制成25g/L的蜂膠TSA液,采用倍比稀釋法將蜂膠配制成不同的濃度,最高濃度為25g/L,最低濃度為0.10g/L,共9個濃度,每支試管分裝成1ml;采用麥?zhǔn)媳葷岱ㄓ肨SA液體培養(yǎng)基將4種細(xì)菌配成細(xì)菌混懸液1.5×106 CFU/ml,分別取0.05 ml菌液加入1 ml含不同濃度蜂膠的TSA中,37℃微需氧活化培養(yǎng)48h(900ml/L N2,100 ml/L CO2),觀察結(jié)果,實驗管呈現(xiàn)澄明,搖勻后仍澄明者,認(rèn)為該管無菌生長,從無菌生長的各管中找出最低藥物濃度的實驗管,該管的藥物濃度即為最小抑菌濃度(MIC)。然后,將未見細(xì)菌生長的各管培養(yǎng)物各取一接種環(huán)涂布在TSA瓊脂培養(yǎng)基中,37℃微需氧活化培養(yǎng)48h(900ml/L N2,100 ml/L CO2),平板上無菌落生長的最小稀釋度的藥物濃度即為最小殺菌濃度(MBC)。每一菌株的測定均重復(fù)3次,取MIC、MBC均值。設(shè)立陰性對照組和陽性對照組。 3.蜂膠對S.m、S.m-FR、S.s、S.s-FR葡糖基轉(zhuǎn)移酶的影響。 將100g/L的蜂膠溶液用雙蒸水將其稀釋成6.25、3.13、1.56、0.78、0.39g/L共5個濃度以備用。將冷凍保存的菌種S.m、S.m-FR、S.s、S.s-FR微需氧活化培養(yǎng)48h經(jīng)鑒定后,采用麥?zhǔn)媳葷岱▽?種細(xì)菌配成1.5×108 CFU/ml,各取5 ml菌液分別接種于50ml含10g/L蔗糖的TSB液體培養(yǎng)液中,37℃微需氧活化培養(yǎng)18h(900ml/L N2,100 ml/L CO2)。將上述細(xì)菌培養(yǎng)物離心(3 300×g,20min,4℃),收集上清液,加入固體硫酸銨達(dá)60%飽和度,置4℃冰箱過夜,離心(10 000×g,30min,4℃)后收集沉淀,將沉淀溶于含0.01% NaNO3的0.01mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.4)后用相同緩沖液透析48h,每12小時換1次液體,聚乙二醇(相對分子質(zhì)量100 000)濃縮至5ml得GTF粗酶。取粗制酶液0.05ml,0.1ml 0.5mol/L磷酸鹽緩沖液(pH 6.0),0.1ml 0.5mol/L蔗糖,0.4ml雙蒸水,以及不同濃度的蜂膠溶液0.05ml,37℃孵育1h,加0.1ml 0.24mol/L HCL終止反應(yīng),再加2.5ml雙蒸水混勻,離心2 000×g,5min,上清液的還原糖用Neson-Somogyi法測定。以空白管調(diào)零,于波長為620nm處讀取光密度值[D(620)]。實驗共分7組,即5個不同濃度的實驗組和2個對照組,每組6個平行管,每管測定3次,結(jié)果取其均值。設(shè)立陰性對照組和陽性對照組。 結(jié)果: 1.所獲得的耐氟菌株在不含NaF的TSA上連續(xù)傳代20次后,仍可以在含1000 mg/L NaF的TSA培養(yǎng)基中生長,其顯微鏡下菌體形態(tài)較親代菌株稍膨大,生化反應(yīng):S.m,S.m-FR甘露醇、山梨醇、棉子糖、密二糖為陽性反應(yīng),精氨酸為陰性反應(yīng);S.s,S.s-FR甘露醇、山梨醇為陽性反應(yīng),棉子糖、密二糖、精氨酸為陰性反應(yīng),只是耐氟菌株比親代菌株陽性出現(xiàn)時間晚。 2.水溶性蜂膠對S.m、S.m-FR、S.s、S.s-FR最小抑菌濃度(MIC)分別為0.39 g/L、0.78 g/L、0.20 g/L、0.39g/L;最小殺菌濃度(MBC)分別為0.78 g/L、1.56 g/L、1.56 g/L、1.56g/L。 3.6.25g/L、3.13 g/L、1.56g/L、0.78 g/L、0.39g/L的蜂膠對S.m、S.m-FR、S.s、S.s-FR的GTF均有抑制作用,各蜂膠濃度組與陽性對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),6.25、3.13 g/L和1.56 g/L 3組與0.78、0.39 g/L 2組之間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。 結(jié)論: 1.在蜂膠濃度為0.78g/L時,能完全抑制變形鏈球菌、遠(yuǎn)緣鏈球菌及其耐氟菌株的生長;在蜂膠濃度為1.56g/L時,能完全殺滅變形鏈球菌、遠(yuǎn)緣鏈球菌及其耐氟菌株。 2.在出現(xiàn)耐氟菌株時,國產(chǎn)水溶性蜂膠能將其抑制或殺滅,這提示國產(chǎn)水溶性蜂膠可有效抑制或殺滅變形鏈球菌和遠(yuǎn)緣鏈球菌及其耐氟菌株。 3.國產(chǎn)水溶性蜂膠對GTF活性有一定的抑制作用,隨著蜂膠濃度升高,S.m、S.m-FR、S.s、S.s-FR 4種菌的GTF活性逐漸降低,但當(dāng)濃度達(dá)1.56g/L時,抑制GTF活性的作用不再增強。 4.國產(chǎn)水溶性蜂膠在預(yù)防齲病方面具有一定的研究價值。
【圖文】：

圖 2 變形鏈球菌、變形鏈球菌耐氟菌株在 TSA 培養(yǎng)基中Fig 2 S. mutans and S. mutans fluoride-resistant strains in the TSA

圖 2 變形鏈球菌、變形鏈球菌耐氟菌株在 TSA 培養(yǎng)基中Fig 2 S. mutans and S. mutans fluoride-resistant strains in the TSA
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R781.1;R285.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2700406