【摘要】：金屬鈦因其良好的耐腐蝕性、生物相容性和骨整合性,在臨床上已廣泛用作于牙科修復(fù)種植體、正畸支抗種植體或人工關(guān)節(jié)。鈦種植體穩(wěn)定性是其植入成功的關(guān)鍵,多種活性肽和蛋白已被用于修飾鈦種植體表面,以促進(jìn)骨與種植體之間的達(dá)到穩(wěn)定的骨性整合。RGD (Arg-Gly-Asp)肽作為大部分細(xì)胞外基質(zhì)蛋白(包括一些礦化相關(guān)蛋白)的共有序列,是目前最有效和應(yīng)用廣泛和的促進(jìn)生物材料表面細(xì)胞粘附的肽,而如何將肽固定于生物材料的表面是提高細(xì)胞粘附的前提。學(xué)者們試圖借助于羥基、氨基或羧基等功能基團(tuán),將RGD通過共價結(jié)合的方式固定在生物材料的表面。然而,這些偶聯(lián)方式存在一些缺點：除了復(fù)雜的處理過程外,偶聯(lián)劑的毒性或者活性基團(tuán)因水解而失活等現(xiàn)象均不容忽視。TBP-1 (RKLPDAPGMHTW)是一種新的從12肽噬菌體庫中分離出來的肽適體,其具有與金屬鈦特異性相互作用的能力,其N端的RKLPDA (minTBP-1)序列是鈦結(jié)合的重要位點。鑒于其對鈦強(qiáng)大的特異性識別能力,minTBP-1常以與其他基序相結(jié)合形成融合肽,使得這些融合肽被賦予了同樣的對鈦特異性識別的能力。鑒于此,本研究合成一種含有RGD和minTBP-1序列的融合—RKLPDAPRGDN,探討其與鈦表面的相互作用；以及用該融合肽作為鈦表面涂層,探討對成骨細(xì)胞附著、伸展、增殖、分化及礦化功能方面的影響。 第一部分融合肽minTBP-1-PRGDN與鈦表面相互作用的研究 目的探討融合肽minTBP-1-PRGDN、minTBP-1及PRGDN在不同濃度時對鈦親和性的影響；氧化和未氧化鈦表面對三種肽結(jié)合能力的影響；FITC標(biāo)記對肽結(jié)合能力影響。 方法實驗一：鈦片經(jīng)順序打磨、清洗、消毒備用,三種肽以不同濃度(1μg/ml,10μg/ml, 100μg/ml, 1000μg/ml)孵育鈦片過夜,雙蒸水洗去未結(jié)合的肽。實驗二：鈦片經(jīng)順序打磨、清洗、一部分經(jīng)30%硝酸氧化(另一部分不氧化)、消毒備用,XPS檢測氧化與未氧化鈦片表面元素成分；三種肽以100μg/ml濃度分別孵育氧化和未氧化的鈦片過夜,雙蒸水洗去未結(jié)合的肽。實驗三：鈦片經(jīng)順序打磨、清洗、氧化、消毒備用,三種肽以100μg/ml濃度按照未標(biāo)記與標(biāo)記比例為0：1(None)、10:1、100:1分別孵育鈦片過夜,雙蒸水洗去未結(jié)合的肽。熒光顯微鏡拍照,IPP圖像分析軟件采集熒光照片的像素點、以平均每個鈦片上的熒光像素點的數(shù)量作為結(jié)合到鈦片表面的肽數(shù)量的間接反映。 結(jié)果實驗一：三種肽隨著濃度的增加其結(jié)合到鈦片上的數(shù)量均逐漸增加,100μg/ml時各種肽在鈦片的結(jié)合接近飽和。實驗二：經(jīng)氧化后的鈦片表面氧元素含量增加；minTBP-1-PRGDN和minTBP-1在氧化的鈦片表面的結(jié)合數(shù)量增加,而PRGDN肽數(shù)昊減少。實驗三：隨著未標(biāo)記肽摻入到標(biāo)記肽中的比例增加,鈦片表面熒光數(shù)量減少。 第二部分融合肽minTBP-1-PRGDN對成骨細(xì)胞粘附的影響 目的探討不同肽涂層的鈦表面對成骨細(xì)胞附著數(shù)量、伸展形態(tài)及面積、粘附相關(guān)基因表達(dá)的影響。 方法鈦片經(jīng)順序打磨、清洗、氧化、消毒備用,三種肽以100μg/ml濃度孵育鈦片表面過夜,未有肽孵育組作為空白對照；PBS洗去未結(jié)合的肽；成骨細(xì)胞在鈦片表面生長一定時間后(實驗四、五為1h,實驗六為24h),PBS洗去未粘附細(xì)胞。實驗四：Alamar Blue比色法檢測附著細(xì)胞的數(shù)量;實驗五：FITC-鬼筆環(huán)肽染色粘附細(xì)胞,熒光顯微鏡照相,IPP軟件分析細(xì)胞伸展面積；實驗六：RT-PCR熒光定量檢測Integrinβ1和Cadherin-11基因表達(dá)。 結(jié)果實驗四：minTBP-1-PRGDN涂層鈦片上附著的成骨細(xì)胞數(shù)量最多、PRGDN涂層組的細(xì)胞數(shù)量最少：實驗五：minTBP-1-PRGDN融合肽涂層的鈦片表面的成骨細(xì)胞伸展充分、面積最大,但細(xì)胞偽足少；PRGDN涂層的鈦片表面成骨細(xì)胞伸展最不充分,多接近于立方形,伸展面積與其他各組相比也是最��；實驗六：Integrinβ1和Cadherin-11基因表達(dá)量在PRGDN組均為最高。 第三部分融合肽minTBP-1-PRGDN對成骨細(xì)胞增殖的影響 目的探討不同肽涂層的鈦表面對成骨細(xì)胞增殖數(shù)量、形態(tài)及相關(guān)基因表達(dá)的影響。 方法實驗七：MTT比色法檢測四組成骨細(xì)胞在24h、48h、72h時的增殖數(shù)量；細(xì)胞經(jīng)Giemsa's染色后金相顯微鏡觀察在增殖72h時的形態(tài)；實驗八：RT-PCR熒光定量檢測Collagen la 1和Cyclin D1基因表達(dá)。 結(jié)果實驗七：各組細(xì)胞隨時間延長數(shù)量逐漸增加,24h時minTBP-1-PRGDN涂層鈦片表面的成骨細(xì)胞數(shù)量最多；72h時各組細(xì)胞大部分呈長梭形,伸展充分,并沿著鈦片表面打磨的痕跡方向排列；實驗八：cyclin D1:對照組外,其余各組表達(dá)量隨時間延長而增加;達(dá)到72h時,minTBP-1-PRGDN組的cyclin D1表達(dá)量最大。CollagenⅠα1：各組表達(dá)量隨時間延長降低后又有所增高；24 h時,PRGDN組的表達(dá)量最高；48h時,空白對照組表達(dá)量最低；72h時,minTBP-1組表達(dá)量最高。 第四部分融合肽minTBP-1-PRGDN對成骨細(xì)胞分化及功能的影響 目的探討不同肽涂層的鈦表面對成骨細(xì)胞分化過程中ALP酶活性、礦化相關(guān)基因表達(dá)、礦化結(jié)節(jié)形成數(shù)量及面積大小的影響。 方法實驗九：PNPP法檢測成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化第3,7,10,14,21,28d時的ALP酶活性;實驗十：RT-PCR熒光定量檢測ALP、OPN、BSP、OC基因表達(dá)；實驗十一：細(xì)胞誘導(dǎo)礦化28d后,茜素紅染色礦化結(jié)節(jié),金相顯微鏡照相,IPP軟件分析各組結(jié)節(jié)數(shù)量及平均面積。 結(jié)果實驗九：各組成骨細(xì)胞誘導(dǎo)3-10d內(nèi),ALP活性值緩慢遞增,從14d開始,ALP量的增加開始加速,28d時達(dá)到峰值；實驗十：minTBP-1-PRGDN涂層表面成骨細(xì)胞分泌的OPN、OC、BSP及ALP四種基因的表達(dá)趨勢均為：隨著時間的延長,表達(dá)量先上升后降低,且在第14天時達(dá)到高峰。而minTBP-1涂層表面成骨細(xì)胞分泌的這四種基因的表達(dá)趨勢均為隨著時間的延長,表達(dá)量逐漸上升�？瞻讓φ战M中,除了OC表達(dá)先降低后增高以外,其余三種基因的表達(dá)均為逐漸升高。而PRGDN組中除了BSP的表達(dá)先增加后減少外,其他三種基因的表達(dá)均為先降低升高。四種基因在第7d時,PRGDN組的表達(dá)均為最高；第14d時minTBP-1-PRGDN組表達(dá)量最高；實驗十一：minTBP-1-PRGDN組的結(jié)節(jié)面積最大而minTBP-1組的平均面積最小；結(jié)節(jié)數(shù)量在PRGDN組最多而minTBP-1組最少。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號】：R783

【參考文獻(xiàn)】

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1 余克強(qiáng);補(bǔ)腎中藥血清對體外培養(yǎng)成骨細(xì)胞合成堿性磷酸酶及骨鈣素的調(diào)控[J];中國臨床康復(fù);2005年34期

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本文編號：2699234