【摘要】：背景:口腔感染一直以來都被人們忽視�？谇活M面部的神經(jīng)血管存在于充滿蜂窩組織的間隙內(nèi),并在間隙中穿行,感染便由近及遠(yuǎn)在各間隙內(nèi)擴(kuò)散,形成多間隙感染�？谇活M面間隙感染的患者,初期略感面部不適,相應(yīng)間隙受到累及后,會出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng),皮膚發(fā)紅,面部腫脹,觸診熱,有自發(fā)痛和觸痛,膿腫形成后會出現(xiàn)明顯的波動感。主要通過牙源性和腺源性感染導(dǎo)致牙齒疾病、頜面部腺體疾病、牙周感染或普通潰瘍等一些輕度疾病。如果在早期沒有得到有效的治療,致使引發(fā)頜面部相關(guān)組織的感染,便會并發(fā)頜面部蜂窩織炎、下頜骨骨髓炎等甚至全身性的感染,嚴(yán)重者甚至?xí)斐缮ｋU(xiǎn)。早期炎癥能夠激活免疫細(xì)胞并釋放腫瘤壞死因子α,啟動了抗炎反應(yīng)。免疫細(xì)胞根據(jù)接收到不同微環(huán)境所傳達(dá)的信號,可發(fā)生炎癥或其他免疫調(diào)節(jié)等。如若接收到炎癥信號,感染將進(jìn)一步擴(kuò)散到全身,全身炎癥反應(yīng)會釋放大量的腫瘤壞死因子α(TNF-α)、顆粒酶、白細(xì)胞介素1(IL-1)、氧自由基等促炎因子和介質(zhì),造成淋巴細(xì)胞、樹突細(xì)胞的快速凋亡及中性粒細(xì)胞延緩凋亡,導(dǎo)致免疫抑制。在炎癥反應(yīng)中,TNF-α和白細(xì)胞介素-6(IL-6)是較為典型的炎癥因子。其增加會促進(jìn)炎癥細(xì)胞的招募和聚集,加重炎癥反應(yīng)。目的:利用細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激小鼠結(jié)締組織成纖維細(xì)胞L929及小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7,建立體外口腔頜面部細(xì)菌感染及免疫應(yīng)答模型,檢測不同時(shí)間點(diǎn)炎癥因子的表達(dá)情況。LPS感染C57BL/6小鼠磨牙后區(qū)所對應(yīng)的頜面部位置,建立體內(nèi)口腔頜面部細(xì)菌感染體內(nèi)模型,并檢測相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)炎癥因子的表達(dá)情況。方法:利用10、20、30、40、50、60μg/ml的LPS分別刺激L929及RAW264.7細(xì)胞,采用CCK-8法測定LPS對細(xì)胞增殖的影響。Q-PCR檢測腫瘤壞死因子TNF-α、細(xì)胞炎癥因子、趨化因子等相關(guān)基因的表達(dá)變化情況。ELISA檢測細(xì)胞上清液中IL-6水平變化。70只C57BL/6小鼠根據(jù)LPS給藥濃度的不同分為7組:實(shí)驗(yàn)A組(給予LPS 5μg/ml)、實(shí)驗(yàn)B組(給予LPS 10μg/ml)、實(shí)驗(yàn)C組(給予LPS15μg/ml)、實(shí)驗(yàn)對照D組(給予A組相同量的生理鹽水)、實(shí)驗(yàn)對照E組(給予B組相同量的生理鹽水)、實(shí)驗(yàn)對照F組(給予C組相同量的生理鹽水)、正常對照組G組(對小鼠頜面部不做任何處理,其他同實(shí)驗(yàn)組小鼠)。根據(jù)每組不同處理將藥物注射于約小鼠磨牙后區(qū)所對應(yīng)的頜面部位置。分別在3,6,12,24,48,72h對小鼠活動狀態(tài)及頜面部進(jìn)行觀察。并于72h處死小鼠,取感染部位組織進(jìn)行HE染色,取血清進(jìn)行ELISA檢測。結(jié)果:CCK-8結(jié)果顯示,L929細(xì)胞在LPS刺激24h,濃度小于20μg/ml時(shí),細(xì)胞增殖率顯著上升(P0.01);而隨著濃度的增加(30-50μg/ml),細(xì)胞增殖率開始下降;濃度到達(dá)50μg/ml時(shí),細(xì)胞增殖趨于平穩(wěn)。RAW264.7細(xì)胞在LPS刺激24h,濃度小于50μg/ml時(shí),細(xì)胞增殖率顯著上升(P0.01);而大于50μg/ml時(shí),細(xì)胞增殖率有所回落。QPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TNF-α,IL-1,IL-5,IL-6,IL-8,IL-33的mRNA表達(dá)明顯升高,而IL-10,IL-13,IL-23表達(dá)明顯下降。CXCL2,CXCL10,FOXO3,GDF15表達(dá)量顯著增加。ELISA結(jié)果顯示50μg/m L LPS刺激24h、48h,L929細(xì)胞分泌IL-6含量分別為42.04pg/ml、45.52pg/mL;RAW264.7細(xì)胞分泌IL-6含量為25.90pg/ml,28.92pg/ml。100μg/ml LPS刺激24h、48h,L929細(xì)胞分泌IL-6的含量為18.97pg/ml、21.29pg/ml;RAW264.7細(xì)胞分泌IL-6含量為16.90pg/ml,18.21pg/ml。在LPS感染C57BL/6小鼠頜面部的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中,當(dāng)LPS注入4h開始,小鼠便出現(xiàn)行動緩慢,觸碰反應(yīng)遲鈍。72h后,實(shí)驗(yàn)組體重平均下降了4±1g,小鼠出現(xiàn)攝食下降、排泄物粘結(jié)在肛門附近、懸尾無明顯反抗、行動遲緩等抑郁行為。從感染部位纖維結(jié)締組織、唾液腺組織、肌肉組織均發(fā)生病理改變,出現(xiàn)大量的炎性細(xì)胞浸潤,發(fā)生了炎癥相應(yīng)的組織萎縮、液化、變性、壞死、纖維化。ELISA檢測結(jié)果顯示,血清中炎癥因子IL-6含量從0.419444pg/ml上升到62.62851pg/ml(5μg/ml),TNF-α的含量從0.322800pg/ml升到9.520406pg/ml,而在LPS濃度為15μg/ml時(shí),IL-6和TNF-α的含量分別為24.8694pg/ml、7.56178pg/ml(10μg/ml),分別降低了37.75914pg/ml、1.928626pg/ml。結(jié)論:1.不同濃度的LPS刺激L929細(xì)胞,在短時(shí)間作用(≤12h)下對細(xì)胞的生長起持續(xù)抑制作用。2.LPS刺激L929細(xì)胞24h,隨著濃度的增加,細(xì)胞增殖率逐漸上升,到LPS濃度為30μg/ml時(shí),增值率開始下降,說明LPS能夠引起細(xì)胞增長,然而高濃度則會抑制細(xì)胞的生長。3.相同時(shí)間內(nèi),LPS濃度的增加對RAW細(xì)胞增殖無顯著影響。在相同濃度下,LPS在短時(shí)間作用下(≤12h)能夠促進(jìn)RAW細(xì)胞增殖。4.LPS刺激24h,濃度大于50μg/ml時(shí),細(xì)胞增殖率有所回落,說明長時(shí)間LPS的刺激能夠引起RAW細(xì)胞明顯增長而高濃度對細(xì)胞生長有抑制作用。5.LPS刺激L929及RAW264.7細(xì)胞能夠引起細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng),相關(guān)炎癥因子及趨化因子的表達(dá)增加,證明成功建立了口腔頜面部感染體外模型。6.LPS感染C57BL/6小鼠能夠引起口腔頜面部組織內(nèi)發(fā)生炎癥反應(yīng),其纖維結(jié)締組織、唾液腺組織、肌肉組織均發(fā)生了組織液化、變性、纖維化、萎縮、壞死等病理改變。而血清中IL-6和TNF-α的表達(dá)也明顯增加,證明成功建立了口腔頜面部感染體內(nèi)模型。
【圖文】：

第 3 章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果第 3 章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1 體外口腔頜面部感染實(shí)驗(yàn)3.1.1 CCK-8 檢測不同濃度 LPS 對細(xì)胞的增殖的影響。為了探討不同濃度LPS在不同時(shí)間點(diǎn)對于細(xì)胞增殖的影響，，我們通過CCK-8實(shí)驗(yàn)在 6，12，24h 分別檢測了不同濃度 LPS（0-60μg/ml）作用下 L929 和RAW264.7 細(xì)胞增殖情況。兩種細(xì)胞在 450nm 波長下的吸光度值，如圖 1 所示:

第 3 章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果細(xì)胞增殖率升高。而 LPS 濃度增加對于細(xì)胞增殖無顯著影響。不同濃度 LPS 刺激 12h 細(xì)胞生長的曲線變化與 6h 相似，說明在短時(shí)間內(nèi) LPS 能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖。當(dāng) LPS 刺激 24h，濃度小于 50μg/ml 時(shí)，細(xì)胞增殖率顯著上升（P<0.01）；而大于 50μg/ml 時(shí)，細(xì)胞增殖率有所回落，說明長時(shí)間 LPS 刺激能夠引起細(xì)胞明顯增長而高濃度對細(xì)胞生長有抑制作用（圖 1B）。3.1.2 CCK-8 檢測不同濃度 LPS 對細(xì)胞活力的影響。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R782.3

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2692521