【摘要】：背景:口腔感染一直以來都被人們忽視�？谇活M面部的神經(jīng)血管存在于充滿蜂窩組織的間隙內(nèi),并在間隙中穿行,感染便由近及遠在各間隙內(nèi)擴散,形成多間隙感染。口腔頜面間隙感染的患者,初期略感面部不適,相應間隙受到累及后,會出現(xiàn)明顯的炎癥反應,皮膚發(fā)紅,面部腫脹,觸診熱,有自發(fā)痛和觸痛,膿腫形成后會出現(xiàn)明顯的波動感。主要通過牙源性和腺源性感染導致牙齒疾病、頜面部腺體疾病、牙周感染或普通潰瘍等一些輕度疾病。如果在早期沒有得到有效的治療,致使引發(fā)頜面部相關組織的感染,便會并發(fā)頜面部蜂窩織炎、下頜骨骨髓炎等甚至全身性的感染,嚴重者甚至會造成生命危險。早期炎癥能夠激活免疫細胞并釋放腫瘤壞死因子α,啟動了抗炎反應。免疫細胞根據(jù)接收到不同微環(huán)境所傳達的信號,可發(fā)生炎癥或其他免疫調節(jié)等。如若接收到炎癥信號,感染將進一步擴散到全身,全身炎癥反應會釋放大量的腫瘤壞死因子α(TNF-α)、顆粒酶、白細胞介素1(IL-1)、氧自由基等促炎因子和介質,造成淋巴細胞、樹突細胞的快速凋亡及中性粒細胞延緩凋亡,導致免疫抑制。在炎癥反應中,TNF-α和白細胞介素-6(IL-6)是較為典型的炎癥因子。其增加會促進炎癥細胞的招募和聚集,加重炎癥反應。目的:利用細菌脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)刺激小鼠結締組織成纖維細胞L929及小鼠巨噬細胞RAW264.7,建立體外口腔頜面部細菌感染及免疫應答模型,檢測不同時間點炎癥因子的表達情況。LPS感染C57BL/6小鼠磨牙后區(qū)所對應的頜面部位置,建立體內(nèi)口腔頜面部細菌感染體內(nèi)模型,并檢測相應時間點炎癥因子的表達情況。方法:利用10、20、30、40、50、60μg/ml的LPS分別刺激L929及RAW264.7細胞,采用CCK-8法測定LPS對細胞增殖的影響。Q-PCR檢測腫瘤壞死因子TNF-α、細胞炎癥因子、趨化因子等相關基因的表達變化情況。ELISA檢測細胞上清液中IL-6水平變化。70只C57BL/6小鼠根據(jù)LPS給藥濃度的不同分為7組:實驗A組(給予LPS 5μg/ml)、實驗B組(給予LPS 10μg/ml)、實驗C組(給予LPS15μg/ml)、實驗對照D組(給予A組相同量的生理鹽水)、實驗對照E組(給予B組相同量的生理鹽水)、實驗對照F組(給予C組相同量的生理鹽水)、正常對照組G組(對小鼠頜面部不做任何處理,其他同實驗組小鼠)。根據(jù)每組不同處理將藥物注射于約小鼠磨牙后區(qū)所對應的頜面部位置。分別在3,6,12,24,48,72h對小鼠活動狀態(tài)及頜面部進行觀察。并于72h處死小鼠,取感染部位組織進行HE染色,取血清進行ELISA檢測。結果:CCK-8結果顯示,L929細胞在LPS刺激24h,濃度小于20μg/ml時,細胞增殖率顯著上升(P0.01);而隨著濃度的增加(30-50μg/ml),細胞增殖率開始下降;濃度到達50μg/ml時,細胞增殖趨于平穩(wěn)。RAW264.7細胞在LPS刺激24h,濃度小于50μg/ml時,細胞增殖率顯著上升(P0.01);而大于50μg/ml時,細胞增殖率有所回落。QPCR實驗結果顯示TNF-α,IL-1,IL-5,IL-6,IL-8,IL-33的mRNA表達明顯升高,而IL-10,IL-13,IL-23表達明顯下降。CXCL2,CXCL10,FOXO3,GDF15表達量顯著增加。ELISA結果顯示50μg/m L LPS刺激24h、48h,L929細胞分泌IL-6含量分別為42.04pg/ml、45.52pg/mL;RAW264.7細胞分泌IL-6含量為25.90pg/ml,28.92pg/ml。100μg/ml LPS刺激24h、48h,L929細胞分泌IL-6的含量為18.97pg/ml、21.29pg/ml;RAW264.7細胞分泌IL-6含量為16.90pg/ml,18.21pg/ml。在LPS感染C57BL/6小鼠頜面部的體內(nèi)實驗中,當LPS注入4h開始,小鼠便出現(xiàn)行動緩慢,觸碰反應遲鈍。72h后,實驗組體重平均下降了4±1g,小鼠出現(xiàn)攝食下降、排泄物粘結在肛門附近、懸尾無明顯反抗、行動遲緩等抑郁行為。從感染部位纖維結締組織、唾液腺組織、肌肉組織均發(fā)生病理改變,出現(xiàn)大量的炎性細胞浸潤,發(fā)生了炎癥相應的組織萎縮、液化、變性、壞死、纖維化。ELISA檢測結果顯示,血清中炎癥因子IL-6含量從0.419444pg/ml上升到62.62851pg/ml(5μg/ml),TNF-α的含量從0.322800pg/ml升到9.520406pg/ml,而在LPS濃度為15μg/ml時,IL-6和TNF-α的含量分別為24.8694pg/ml、7.56178pg/ml(10μg/ml),分別降低了37.75914pg/ml、1.928626pg/ml。結論:1.不同濃度的LPS刺激L929細胞,在短時間作用(≤12h)下對細胞的生長起持續(xù)抑制作用。2.LPS刺激L929細胞24h,隨著濃度的增加,細胞增殖率逐漸上升,到LPS濃度為30μg/ml時,增值率開始下降,說明LPS能夠引起細胞增長,然而高濃度則會抑制細胞的生長。3.相同時間內(nèi),LPS濃度的增加對RAW細胞增殖無顯著影響。在相同濃度下,LPS在短時間作用下(≤12h)能夠促進RAW細胞增殖。4.LPS刺激24h,濃度大于50μg/ml時,細胞增殖率有所回落,說明長時間LPS的刺激能夠引起RAW細胞明顯增長而高濃度對細胞生長有抑制作用。5.LPS刺激L929及RAW264.7細胞能夠引起細胞發(fā)生炎癥反應,相關炎癥因子及趨化因子的表達增加,證明成功建立了口腔頜面部感染體外模型。6.LPS感染C57BL/6小鼠能夠引起口腔頜面部組織內(nèi)發(fā)生炎癥反應,其纖維結締組織、唾液腺組織、肌肉組織均發(fā)生了組織液化、變性、纖維化、萎縮、壞死等病理改變。而血清中IL-6和TNF-α的表達也明顯增加,證明成功建立了口腔頜面部感染體內(nèi)模型。
【圖文】：

第 3 章 實驗結果第 3 章 實驗結果3.1 體外口腔頜面部感染實驗3.1.1 CCK-8 檢測不同濃度 LPS 對細胞的增殖的影響。為了探討不同濃度LPS在不同時間點對于細胞增殖的影響，，我們通過CCK-8實驗在 6，12，24h 分別檢測了不同濃度 LPS（0-60μg/ml）作用下 L929 和RAW264.7 細胞增殖情況。兩種細胞在 450nm 波長下的吸光度值，如圖 1 所示:

第 3 章 實驗結果細胞增殖率升高。而 LPS 濃度增加對于細胞增殖無顯著影響。不同濃度 LPS 刺激 12h 細胞生長的曲線變化與 6h 相似，說明在短時間內(nèi) LPS 能夠促進細胞增殖。當 LPS 刺激 24h，濃度小于 50μg/ml 時，細胞增殖率顯著上升（P<0.01）；而大于 50μg/ml 時，細胞增殖率有所回落，說明長時間 LPS 刺激能夠引起細胞明顯增長而高濃度對細胞生長有抑制作用（圖 1B）。3.1.2 CCK-8 檢測不同濃度 LPS 對細胞活力的影響。
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R782.3

【參考文獻】

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1 徐志鵬;左國平;靳建亮;;巨噬細胞異質性及其在炎癥調控中的研究進展[J];細胞與分子免疫學雜志;2015年12期

2 陳濤;丁嵐;;膿毒癥炎癥調控的研究進展[J];實用臨床醫(yī)學;2015年06期

3 徐曉滿;張瑞敏;;白細胞介素-6與口腔疾病相關性的研究進展[J];口腔醫(yī)學;2014年06期

4 李佳瑋;蔡協(xié)藝;;口腔頜面部間隙感染病原菌研究現(xiàn)狀[J];口腔頜面外科雜志;2013年03期

5 王嵐;夏佳佳;劉琪;金巖;;脂多糖對人牙周膜干細胞增殖及炎性因子表達的影響[J];華西口腔醫(yī)學雜志;2013年03期

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本文編號：2692521