【摘要】：目的:敲減小鼠腭胚突間充質(zhì)(Embryonic Palatal Mesenchymal,EPM)細(xì)胞初級(jí)纖毛內(nèi)運(yùn)輸系統(tǒng)(Intraflagellar transport,IFT)相關(guān)重要組件Ift88,探討EPM細(xì)胞初級(jí)纖毛與Sonic Hedgehog(Shh)信號(hào)傳遞之間的關(guān)系及IFT88在纖毛解體中的作用。方法:體外培養(yǎng)胚胎13.5天C57BL/6J小鼠EPM細(xì)胞并鑒定,將培育細(xì)胞分為三組,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞慢病毒轉(zhuǎn)染敲減Ift88,空白對(duì)照組細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng),陰性對(duì)照組細(xì)胞轉(zhuǎn)染空載慢病毒培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)1:上述三組細(xì)胞加入分泌性Shh蛋白培養(yǎng)24小時(shí)后提取總蛋白,利用免疫印跡技術(shù)檢測(cè)對(duì)比三組細(xì)胞Shh信號(hào)通路相關(guān)因子Ptch1、Smo、Gli3、Cyclin D1,并比較轉(zhuǎn)錄因子Gli3A/Gli3R的比率變化;同時(shí)對(duì)比三組細(xì)胞纖毛解體相關(guān)蛋白Aurora A、磷酸化Aurora A和HEF1的變化;實(shí)驗(yàn)2:實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞分成兩組分別不加分泌性Shh蛋白(實(shí)驗(yàn)A組)和加入分泌性Shh蛋白(實(shí)驗(yàn)B組),檢測(cè)對(duì)比Gli3A/Gli3R比率變化及Cyclin D1表達(dá)的變化,進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果:實(shí)驗(yàn)1:Smo與Ptch1表達(dá)量在實(shí)驗(yàn)組和空白對(duì)照組中比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。Gli3A/Gli3R比率在實(shí)驗(yàn)組較空白對(duì)照組升高(P0.05),Cyclin D1在實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組相比表達(dá)增加(P0.05);HEF1實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組相比表達(dá)減少(P0.05),Aurora A實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組相比表達(dá)明顯減少(P0.05),磷酸化Aurora A實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;實(shí)驗(yàn)2:實(shí)驗(yàn)A組與實(shí)驗(yàn)B組比較,實(shí)驗(yàn)B組Cyclin D1表達(dá)和Gli3A/Gli3R比率均升高(P0.05)。結(jié)論:敲減Ift88后影響Shh信號(hào)通路相關(guān)組件和纖毛解體相關(guān)蛋白的表達(dá),Shh信號(hào)在小鼠EPM細(xì)胞中可能通過(guò)非依賴(lài)于初級(jí)纖毛的通路傳遞其下游信號(hào)因子,同時(shí)IFT88影響纖毛調(diào)控器HEF1及Aurora A進(jìn)而影響纖毛的穩(wěn)定性。
【圖文】：

突間充質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)娠 13.5 天(Embryo Day, ED13.5)的孕鼠實(shí)施安死術(shù)后，使用 75%酒下取出胚胎，分離獲取腭突，如圖 1,2 所示。將離體腭突放入裝有 4%2 ml EP 管中，4 ℃冰箱過(guò)夜消化 18-24 h，在體視顯微鏡下使用顯微腭突間充質(zhì)，1000 rpm/min 低速離心 5 min，棄上清，，將含有 0.25%EDTA 混合消化液加入 EP 管中，吸管反復(fù)萃打間充質(zhì)，消化為單細(xì)％胎牛血清的 DMEM/F121:1 完全培養(yǎng)基終止消化，1000 rpm 低速離，加入含10％胎牛血清的DMEM/F121:1完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以5接種到 T25 ml 細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，補(bǔ)充培養(yǎng)基到 2.5 ml，移至 5％ CO胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。隔天半量換液，倒置相差顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞生示。待細(xì)胞增殖鋪滿(mǎn)瓶底后用胰酶消化，1:3 比例傳代。細(xì)胞生長(zhǎng)續(xù)試驗(yàn)[25]。

圖 2 ED13.5 小鼠胚胎腭板形態(tài)(50×)(A) 腭板形態(tài) (B) 腭板剪切后形態(tài)Fig.2 Palatal Shelves Morphology of Mouse ED13.5(50×)(A) Palatal Shelves Morphology (B) Posterior Shape of Palatal Shelves after Shearin圖 3 腭胚突間充質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng) 24 h(20×)Fig.3 Embryonic Palatal Mesenchymal Cells Cultured for 24 h(20×)
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R78

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本文編號(hào)：2690010