【摘要】： 組織工程是應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和工程學(xué)的原理，對病損組織結(jié)構(gòu)和功能的修復(fù)與重建進(jìn)行研究開發(fā)的一門新興科學(xué)。與胚胎干細(xì)胞、基因工程一起被認(rèn)為是生命科學(xué)發(fā)展史上的又一里程碑，標(biāo)志著人類將走出單純器官移植領(lǐng)域，步入組織、器官再造的新領(lǐng)域。 骨是最早在實(shí)驗(yàn)室獲得組織工程化的組織之一，是繼皮膚、軟骨之后最有希望進(jìn)入臨床應(yīng)用的組織。但目前組織工程骨應(yīng)用亟需解決的問題有①具有強(qiáng)的增殖和分化功能的多能干細(xì)胞；②組織工程骨的免疫及成骨細(xì)胞庫的建立；③支架材料的強(qiáng)度及和周圍骨床的結(jié)合。基于以上要求，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了以下三部分實(shí)驗(yàn)的研究。 第一部分 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)特性的研究 實(shí)驗(yàn)一 成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定 目的：建立體外分離培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human mesenchymal stem cells HMSCs)的方法。方法：穿刺抽取成人骨髓約20ml，通過離心法獲取HMSCs，體外培養(yǎng)并傳代，觀察原代及傳代細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)及生長規(guī)律，第4代細(xì)胞用礦化液連續(xù)培養(yǎng)30天，在倒置顯微鏡下觀察礦化結(jié)節(jié)形成情況。結(jié)果：體外利用骨髓基質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)液成功培養(yǎng)了HMSCs，并連續(xù)傳代5～7代。利用第4代細(xì)胞用礦化液連續(xù)培養(yǎng)30天，礦化結(jié)節(jié)形成，在細(xì)胞間有鈣鹽沉積。結(jié)論：HMSCs可以在體外培養(yǎng)成功，并可定向誘導(dǎo)為成骨細(xì)胞。 實(shí)驗(yàn)二 成骨細(xì)胞接種于珊瑚體外培養(yǎng)的掃描電鏡觀察 目的：研究家兔成骨細(xì)胞在珊瑚上的貼附與生長。方法：珊瑚處理后，將骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的成骨細(xì)胞與其復(fù)合，體外培養(yǎng)2天、4天、7天、14天、28天后，掃描電鏡下觀察成骨細(xì)胞在珊瑚表面貼附數(shù)量和形態(tài)，分裂增殖能力及功能。結(jié)果：從2天開始，珊瑚表面及孔內(nèi)即有細(xì)胞粘附生長，隨時(shí)間延長，細(xì)胞數(shù)量急劇增加，到14天～28天時(shí)，全部長滿，并分泌大量膠原纖維和形成鈣化結(jié)節(jié)。結(jié)論：西沙群島濱珊瑚作為組織工程骨的載體，在體外與成骨細(xì)胞具有良好的相容性。 實(shí)驗(yàn)三 bFGF和BMP聯(lián)合使用對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的生物學(xué)效應(yīng) 目的：研究不同劑量的堿性成纖維細(xì)胞因子(bFGF)和重組人骨形成蛋白-2(rhBMP2)單獨(dú)或交互作用對成人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)增殖、堿性磷酸酶(ALP)和總蛋白含量合成影響。方法：將培養(yǎng)的BMSCs接種于96孔板，暴 后 慶 第回旱區(qū)大學(xué)俗士學(xué)位蛤文 第3 頁 露于不同濃度的bFG或（和）thBMPZ中，觀察BMSCS增殖、lP活性、蛋白 質(zhì)含量的變化。結(jié)果：ie’n－可明顯僻BMSCs的增殖，但卻抑制Al，和總蛋白 含量；rhBMIQ對BMSCS的減性磷酸酶活性、蛋白質(zhì)含量均有明顯的促進(jìn)作用， 且呈劑量依賴性，rilnMtu對BMSCs的增殖也有—定促進(jìn)作用；而二者交互聯(lián)合 應(yīng)用對BMSCs的增殖和分化有協(xié)同作用。結(jié)論：二者交互聯(lián)合使用，可提高BMSCs 向成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)化和增殖并提高骨形成的生物效應(yīng)。 第二部分 組織工程骨的構(gòu)建及免疫學(xué)研究 實(shí)鉻一 高孔隙串濱矚瑚用于組織工程骨的構(gòu)建 目的：探討西抄群島蔚慣輝瞞珊晚眸為骨組織工程皮韶刺料的可行性。方法：取 4周齡兔骨髓，分離骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，懈僻，經(jīng)誘導(dǎo)狐為成骨細(xì)胞，欲 至濱珊瑚材料，植入裸贓一中。對照組單純植入擯珊猢。分另于旱、8周取 材，行大體觀察、XHN，觀察新骨形成倩況。結(jié)果：4周時(shí)X線 片有店碎密度陰身伯以象，HE染名…u閃宅所骨形咸 呂周時(shí)X線陰舊拈敦像密度更高， HE染色可見大量新骨形成并相互連接依滑，J擇絹貧胸，骨細(xì)胞位于陷窩中。結(jié)論： 高孔隙率濱珊瑚可以作為骨組織口口涅的支架材料。 實(shí)驗(yàn)二 同種異體成骨細(xì)胞移桓的免疫學(xué)研究 目的：孤－一，探討組織工程骨組織植 人體內(nèi)后可能的免疫排斥機(jī)制，并為應(yīng)用于工程骨的種子細(xì)胞尋找可靠的種系來 源。施行成骨細(xì)胞同胎、同膿體、同種異棚及自腳－內(nèi)雕， 分另于術(shù)后1周、2周、4周、8周行免疫學(xué)及組織沮態(tài)u。結(jié)果：各組動(dòng)物在 浴時(shí)直后玉侖周內(nèi)均司耘覷9筍怵杉襯掃亢體，同種異基因移眶淚狂茨賣時(shí)間最久，，異基因 組隧拽掃崗昏際高于同闌哆糾駟組。結(jié)論：自體、同胎及同種異體或同陽咕契塞因細(xì)胞均 可作為組織江程骨移植可靠的細(xì)胞來源。 實(shí)驗(yàn)三 以羹巨為活休生物反廈呂構(gòu)建可移植組織工程骨的可 研究 目的：研究以裸鼠為活體生物反應(yīng)氓奸朗彭組織D用群罰茨廳自體私陽拍飯刃廳性。方法 常城胰竅日舟固眨間夭洞定R翊胞后，選取第四腳胞向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化。與珊瑚復(fù) 4iR 崔pV課即內(nèi)，巴周后取出形瀝凌1罪剁織，放人自林家舊炙炎抑嘰肉組織間隙 中，分別于14、28、56 XNll：silllirff中棚鼠扶中陀瓤竟及2、7、14、28、56天檢 測thZ水平，8周標(biāo)本行免疫組化灤色，判定局部免疫反應(yīng)水平。結(jié)果：整個(gè)實(shí) 驗(yàn)過程
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2002
【分類號】：R782

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2688734