【摘要】：牽張成骨技術(shù)（DO）已經(jīng)成為治療頜骨畸形或缺損的重要方法，但成骨機(jī)制尚不清楚。DO中骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）首先要脫離干細(xì)胞龕才能向成骨方向分化，因此MSCs的動(dòng)員是骨再生的先決調(diào)節(jié)。已知MSCs屬血管周細(xì)胞的一個(gè)亞群，受血管內(nèi)皮干細(xì)胞龕的控制，而交感神經(jīng)在骨的代謝中起著非常重要的作用，交感神經(jīng)能反向調(diào)控骨再生，且多伴行于血管分布，因此我們推測(cè)交感神經(jīng)對(duì)MSCs動(dòng)員及遷移有一定的調(diào)控作用，目前尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究在大鼠下頜骨牽張成骨復(fù)合頸交感干離斷模型的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討交感神經(jīng)在牽張應(yīng)力下調(diào)控MSCs動(dòng)員的分子機(jī)理，揭示DO的骨再生機(jī)制提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為臨床上改進(jìn)DO技術(shù)提供更全面的理論支持。本文分為6個(gè)部分： 1SD大鼠下頜骨交感神經(jīng)與干細(xì)胞分布關(guān)系的研究 目的：檢測(cè)SD大鼠下頜骨交感神經(jīng)分布與干細(xì)胞龕的關(guān)系。方法：SD成年雄性大鼠2只處死，取雙側(cè)下頜骨，對(duì)交感神經(jīng)纖維標(biāo)志物TH及MSCs標(biāo)志物Nestin的表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果：免疫組化染色顯示，大鼠下頜骨TH/Nestin表達(dá)分布關(guān)系密切，且交感神經(jīng)纖維與血管伴行。結(jié)論：大鼠下頜骨交感神經(jīng)與MSCs關(guān)系密切，為下一步研究提供了解剖學(xué)依據(jù)。 2大鼠下頜骨牽張成骨復(fù)合頸交感干神經(jīng)離斷術(shù)模型的建立 目的：建立大鼠下頜骨牽張成骨復(fù)合頸交感干神經(jīng)離斷術(shù)模型。方法：SD成年雄性大鼠6只，分兩組，實(shí)驗(yàn)組全麻下先行雙側(cè)頸交感干離斷術(shù)，后行右側(cè)下頜骨外置式牽張器植入術(shù)，對(duì)照組僅行右側(cè)下頜骨外置式牽張器植入術(shù)。術(shù)后觀察大鼠霍納征眼部表現(xiàn)；固定期2周處死，行離斷神經(jīng)節(jié)組織學(xué)檢測(cè)及下頜骨標(biāo)本牽張區(qū)的大體觀察和組織切片HE染色。結(jié)果：6只大鼠均耐受手術(shù)，實(shí)驗(yàn)組出現(xiàn)雙側(cè)霍納征，對(duì)照組正常；牽張器固定良好，兩組右側(cè)下頜骨均被成骨延長(zhǎng)，平均長(zhǎng)度為3.4mm，達(dá)預(yù)期長(zhǎng)度85%，HE染色示兩組牽張間隙均出現(xiàn)新生骨小梁，但頸交感干離斷組骨小梁數(shù)量更多且更加致密。結(jié)論：大鼠下頜骨牽張成骨復(fù)合頸交感干神經(jīng)離斷術(shù)模型具有良好的可行性與重復(fù)性，適合牽張成骨中相關(guān)分子機(jī)制的研究。 3斷頸交感神經(jīng)干大鼠DO中牽張區(qū)NE/adrb3的表達(dá)及其與MSCs動(dòng)員關(guān)系的研究 目的：檢測(cè)斷頸交感神經(jīng)干后牽張區(qū)NE/adrb3、Nestin的表達(dá)情況，并分析其中的關(guān)聯(lián)性。方法：SD成年雄性大鼠20只，分四組（n=5），實(shí)驗(yàn)組行右側(cè)下頜骨牽張器植入術(shù)復(fù)合頸交感神經(jīng)干離斷書(shū)，對(duì)照組行右側(cè)下頜骨牽張器植入術(shù)，分別于牽張期開(kāi)始和牽張期結(jié)束處死并取材，行免疫組化檢測(cè)。結(jié)果：NE/adrb3主要于表達(dá)血管周，與對(duì)照組相比，斷交感神經(jīng)后NE/adrb3隨著時(shí)間延長(zhǎng)，表達(dá)逐漸減弱，到牽張期結(jié)束已無(wú)明顯表達(dá)；實(shí)驗(yàn)組Nestin在牽張期開(kāi)始及結(jié)束時(shí)，均廣泛表達(dá)于成骨基質(zhì)和血管周，且主要集中于成骨基質(zhì)，而對(duì)照組Nestin主要表達(dá)于血管周。結(jié)論：DO中交感神經(jīng)通過(guò)NE/adrb3反向調(diào)控MSCs動(dòng)員及向成骨基質(zhì)遷移。 4斷頸交感神經(jīng)干大鼠DO中牽張區(qū)SDF-1表達(dá)的研究 目的：檢測(cè)斷頸交感神經(jīng)干后牽張區(qū)SDF-1的表達(dá)情況。方法：SD成年雄性大鼠30只，分6組（n=5），實(shí)驗(yàn)組行右側(cè)下頜骨牽張器植入術(shù)復(fù)合頸交感神經(jīng)干離斷書(shū)，對(duì)照組行右側(cè)下頜骨牽張器植入術(shù)，分別于牽張期結(jié)束、固定期2周及固定期4周處死并取材，行免疫熒光檢測(cè)。結(jié)果：免疫熒光顯示，DO+TCST組在各個(gè)時(shí)間段，牽張區(qū)成骨基質(zhì)或骨小梁SDF-1表達(dá)都明顯高于血管周，且血管周SDF-1表達(dá)百分比要明顯低于DO組；DO組從固定期2周開(kāi)始，骨小梁周與血管周SDF-1表達(dá)已無(wú)明顯差異。結(jié)論TCST能使?fàn)繌垍^(qū)SDF-1形成從血管周到成骨基質(zhì)由低到高濃度梯度。 5大鼠下頜骨MSCs的分離培養(yǎng)及相關(guān)受體的表達(dá)的鑒定 目的：組織塊消化貼壁篩選法分離培養(yǎng)大鼠下頜骨MSCs，并鑒定表面受體Nestin、adrb3及CXCR4的表達(dá)。方法：組織塊消化法培養(yǎng)大鼠下頜骨MSCs，進(jìn)行生長(zhǎng)曲線測(cè)定及干細(xì)胞表面標(biāo)志流式細(xì)胞術(shù)鑒定；成骨、成脂誘導(dǎo)分化；Nestin/adrb3、CXCR4細(xì)胞免疫組化檢測(cè)。結(jié)果：大鼠下頜骨MSCs流式細(xì)胞術(shù)鑒定其細(xì)胞表面標(biāo)志物特征為CD29、CD44、CD90陽(yáng)性，，CD34和CD45陰性；在體外可大量擴(kuò)增，符合典型的MSCs形態(tài)特征及生長(zhǎng)增殖規(guī)律；細(xì)胞表面表達(dá)Nestin、adrb3及CXCR4。結(jié)論：培養(yǎng)的大鼠下頜骨MSCs具有自我更新和多向分化能力，為NE和SDF-1的靶細(xì)胞，能為后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供可靠的MSCs和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 6NE對(duì)大鼠下頜骨MSCs增殖、分化及遷移影響的研究 目的：檢測(cè)NE對(duì)大鼠頜骨MSCs增殖、分化及遷移的影響。方法：分別將10-7mol/L NE共培養(yǎng)MSCs與常規(guī)培養(yǎng)MSCs，進(jìn)行細(xì)胞倍增指數(shù)、Brdu標(biāo)記法檢測(cè)及成骨誘導(dǎo)分化。Transwell遷移小室模型中，上室分別加入200μL含濃度為10-7mol/L NE或不含NE的GFP-MSCs（5×10~5/ml）單細(xì)胞懸液，下室加入200μL含SDF-1α（25ng/mL）的DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)12小時(shí)后計(jì)數(shù)遷移細(xì)胞。結(jié)果：10-7mol/L NE共培養(yǎng)MSCs其細(xì)胞倍增數(shù)、BrdU陽(yáng)性細(xì)胞百分比、礦化結(jié)節(jié)均少于對(duì)照組。含10-7mol/L NE組遷移細(xì)胞數(shù)量明顯低于對(duì)照組，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.05）。結(jié)論：NE負(fù)向調(diào)控MSCs增殖及分化能力，并抑制MSCs在SDF-1誘導(dǎo)下的遷移能力。
【圖文】：

圖 1 脛骨骨髓交感神經(jīng)分布[68]神經(jīng)與骨代謝感神經(jīng)纖維廣泛分布于骨骼系統(tǒng)的理論基礎(chǔ)上，1998 年 Maestro髓中存在兒茶酚胺類(lèi)物質(zhì)-交感神經(jīng)遞質(zhì) NE，其水平呈現(xiàn)節(jié)律性峰值，交感神經(jīng)抑制劑 6-羥多巴胺（交感神經(jīng)特異性神經(jīng)毒藥物E 水平，同時(shí)發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的骨髓淋巴樣細(xì)胞能分泌 NE 等兒茶 NE 的神經(jīng)源性和細(xì)胞性。1999 年 Tang 等[72]采用多種干預(yù)方法化規(guī)律進(jìn)行了更加深入的研究，提出了骨髓中 NE 具有功能性變是針對(duì)全身的應(yīng)激反應(yīng)，并且參與調(diào)節(jié)骨髓中淋巴細(xì)胞及其他細(xì)紀(jì) 80 年代，已有多名學(xué)者發(fā)現(xiàn)體內(nèi)骨髓中成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞Rs 的表達(dá)[73-76]； 并且施加 β-ARs 激動(dòng)劑能促進(jìn)白介素-6,11 及

Yamaza 等[139]還發(fā)現(xiàn)頜骨 MSCs 的自我更新、成骨成脂分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在 SNS 調(diào)控下的動(dòng)員與遷移充質(zhì)干細(xì)胞龕內(nèi)組織存在的干細(xì)胞并不是游離狀態(tài)，而是被干細(xì)胞龕所控于器官或組織中的可以維持干細(xì)胞的自我更新及避免分化的細(xì)胞外基質(zhì)和來(lái)源于龕細(xì)胞的可溶性因子(SDF-1，Notch 1,egrin 等)（圖 3）[112-115]。根據(jù)干細(xì)胞在體內(nèi)組織的分布位置，。例如，被廣泛用于臨床骨髓移植的 HSC 在骨髓中存在于兩骨細(xì)胞外圍，因而血管內(nèi)皮細(xì)胞和成骨細(xì)胞分別是構(gòu)成這兩部分[113, 116]。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類(lèi)號(hào)】：R782.23

【參考文獻(xiàn)】

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2 魏奉才;張東;劉少華;孫善珍;;整合素α_Vβ_3在下頜牽張成骨過(guò)程中表達(dá)的實(shí)驗(yàn)研究[J];華西口腔醫(yī)學(xué)雜志;2005年06期

3 白丁,王大章;利用牽張成骨矯治嚴(yán)重后牙鎖

本文編號(hào)：2685010