【摘要】：牽張成骨技術（DO）已經(jīng)成為治療頜骨畸形或缺損的重要方法，但成骨機制尚不清楚。DO中骨髓間充質(zhì)干細胞（MSCs）首先要脫離干細胞龕才能向成骨方向分化，因此MSCs的動員是骨再生的先決調(diào)節(jié)。已知MSCs屬血管周細胞的一個亞群，受血管內(nèi)皮干細胞龕的控制，而交感神經(jīng)在骨的代謝中起著非常重要的作用，交感神經(jīng)能反向調(diào)控骨再生，且多伴行于血管分布，因此我們推測交感神經(jīng)對MSCs動員及遷移有一定的調(diào)控作用，目前尚未見相關報道。本研究在大鼠下頜骨牽張成骨復合頸交感干離斷模型的基礎上，進一步探討交感神經(jīng)在牽張應力下調(diào)控MSCs動員的分子機理，揭示DO的骨再生機制提供重要的實驗依據(jù)，為臨床上改進DO技術提供更全面的理論支持。本文分為6個部分： 1SD大鼠下頜骨交感神經(jīng)與干細胞分布關系的研究 目的：檢測SD大鼠下頜骨交感神經(jīng)分布與干細胞龕的關系。方法：SD成年雄性大鼠2只處死，取雙側(cè)下頜骨，對交感神經(jīng)纖維標志物TH及MSCs標志物Nestin的表達進行檢測。結(jié)果：免疫組化染色顯示，大鼠下頜骨TH/Nestin表達分布關系密切，且交感神經(jīng)纖維與血管伴行。結(jié)論：大鼠下頜骨交感神經(jīng)與MSCs關系密切，為下一步研究提供了解剖學依據(jù)。 2大鼠下頜骨牽張成骨復合頸交感干神經(jīng)離斷術模型的建立 目的：建立大鼠下頜骨牽張成骨復合頸交感干神經(jīng)離斷術模型。方法：SD成年雄性大鼠6只，分兩組，實驗組全麻下先行雙側(cè)頸交感干離斷術，后行右側(cè)下頜骨外置式牽張器植入術，對照組僅行右側(cè)下頜骨外置式牽張器植入術。術后觀察大鼠霍納征眼部表現(xiàn)；固定期2周處死，行離斷神經(jīng)節(jié)組織學檢測及下頜骨標本牽張區(qū)的大體觀察和組織切片HE染色。結(jié)果：6只大鼠均耐受手術，實驗組出現(xiàn)雙側(cè)霍納征，對照組正常；牽張器固定良好，兩組右側(cè)下頜骨均被成骨延長，平均長度為3.4mm，達預期長度85%，HE染色示兩組牽張間隙均出現(xiàn)新生骨小梁，但頸交感干離斷組骨小梁數(shù)量更多且更加致密。結(jié)論：大鼠下頜骨牽張成骨復合頸交感干神經(jīng)離斷術模型具有良好的可行性與重復性，適合牽張成骨中相關分子機制的研究。 3斷頸交感神經(jīng)干大鼠DO中牽張區(qū)NE/adrb3的表達及其與MSCs動員關系的研究 目的：檢測斷頸交感神經(jīng)干后牽張區(qū)NE/adrb3、Nestin的表達情況，并分析其中的關聯(lián)性。方法：SD成年雄性大鼠20只，分四組（n=5），實驗組行右側(cè)下頜骨牽張器植入術復合頸交感神經(jīng)干離斷書，對照組行右側(cè)下頜骨牽張器植入術，分別于牽張期開始和牽張期結(jié)束處死并取材，行免疫組化檢測。結(jié)果：NE/adrb3主要于表達血管周，與對照組相比，斷交感神經(jīng)后NE/adrb3隨著時間延長，表達逐漸減弱，到牽張期結(jié)束已無明顯表達；實驗組Nestin在牽張期開始及結(jié)束時，均廣泛表達于成骨基質(zhì)和血管周，且主要集中于成骨基質(zhì)，而對照組Nestin主要表達于血管周。結(jié)論：DO中交感神經(jīng)通過NE/adrb3反向調(diào)控MSCs動員及向成骨基質(zhì)遷移。 4斷頸交感神經(jīng)干大鼠DO中牽張區(qū)SDF-1表達的研究 目的：檢測斷頸交感神經(jīng)干后牽張區(qū)SDF-1的表達情況。方法：SD成年雄性大鼠30只，分6組（n=5），實驗組行右側(cè)下頜骨牽張器植入術復合頸交感神經(jīng)干離斷書，對照組行右側(cè)下頜骨牽張器植入術，分別于牽張期結(jié)束、固定期2周及固定期4周處死并取材，行免疫熒光檢測。結(jié)果：免疫熒光顯示，DO+TCST組在各個時間段，牽張區(qū)成骨基質(zhì)或骨小梁SDF-1表達都明顯高于血管周，且血管周SDF-1表達百分比要明顯低于DO組；DO組從固定期2周開始，骨小梁周與血管周SDF-1表達已無明顯差異。結(jié)論TCST能使牽張區(qū)SDF-1形成從血管周到成骨基質(zhì)由低到高濃度梯度。 5大鼠下頜骨MSCs的分離培養(yǎng)及相關受體的表達的鑒定 目的：組織塊消化貼壁篩選法分離培養(yǎng)大鼠下頜骨MSCs，并鑒定表面受體Nestin、adrb3及CXCR4的表達。方法：組織塊消化法培養(yǎng)大鼠下頜骨MSCs，進行生長曲線測定及干細胞表面標志流式細胞術鑒定；成骨、成脂誘導分化；Nestin/adrb3、CXCR4細胞免疫組化檢測。結(jié)果：大鼠下頜骨MSCs流式細胞術鑒定其細胞表面標志物特征為CD29、CD44、CD90陽性，，CD34和CD45陰性；在體外可大量擴增，符合典型的MSCs形態(tài)特征及生長增殖規(guī)律；細胞表面表達Nestin、adrb3及CXCR4。結(jié)論：培養(yǎng)的大鼠下頜骨MSCs具有自我更新和多向分化能力，為NE和SDF-1的靶細胞，能為后續(xù)實驗提供可靠的MSCs和實驗依據(jù)。 6NE對大鼠下頜骨MSCs增殖、分化及遷移影響的研究 目的：檢測NE對大鼠頜骨MSCs增殖、分化及遷移的影響。方法：分別將10-7mol/L NE共培養(yǎng)MSCs與常規(guī)培養(yǎng)MSCs，進行細胞倍增指數(shù)、Brdu標記法檢測及成骨誘導分化。Transwell遷移小室模型中，上室分別加入200μL含濃度為10-7mol/L NE或不含NE的GFP-MSCs（5×10~5/ml）單細胞懸液，下室加入200μL含SDF-1α（25ng/mL）的DMEM培養(yǎng)液，培養(yǎng)12小時后計數(shù)遷移細胞。結(jié)果：10-7mol/L NE共培養(yǎng)MSCs其細胞倍增數(shù)、BrdU陽性細胞百分比、礦化結(jié)節(jié)均少于對照組。含10-7mol/L NE組遷移細胞數(shù)量明顯低于對照組，具有統(tǒng)計學意義（P0.05）。結(jié)論：NE負向調(diào)控MSCs增殖及分化能力，并抑制MSCs在SDF-1誘導下的遷移能力。
【圖文】：

圖 1 脛骨骨髓交感神經(jīng)分布[68]神經(jīng)與骨代謝感神經(jīng)纖維廣泛分布于骨骼系統(tǒng)的理論基礎上，1998 年 Maestro髓中存在兒茶酚胺類物質(zhì)-交感神經(jīng)遞質(zhì) NE，其水平呈現(xiàn)節(jié)律性峰值，交感神經(jīng)抑制劑 6-羥多巴胺（交感神經(jīng)特異性神經(jīng)毒藥物E 水平，同時發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的骨髓淋巴樣細胞能分泌 NE 等兒茶 NE 的神經(jīng)源性和細胞性。1999 年 Tang 等[72]采用多種干預方法化規(guī)律進行了更加深入的研究，提出了骨髓中 NE 具有功能性變是針對全身的應激反應，并且參與調(diào)節(jié)骨髓中淋巴細胞及其他細紀 80 年代，已有多名學者發(fā)現(xiàn)體內(nèi)骨髓中成骨細胞及破骨細胞Rs 的表達[73-76]； 并且施加 β-ARs 激動劑能促進白介素-6,11 及

Yamaza 等[139]還發(fā)現(xiàn)頜骨 MSCs 的自我更新、成骨成脂分骨髓間充質(zhì)干細胞在 SNS 調(diào)控下的動員與遷移充質(zhì)干細胞龕內(nèi)組織存在的干細胞并不是游離狀態(tài)，而是被干細胞龕所控于器官或組織中的可以維持干細胞的自我更新及避免分化的細胞外基質(zhì)和來源于龕細胞的可溶性因子(SDF-1，Notch 1,egrin 等)（圖 3）[112-115]。根據(jù)干細胞在體內(nèi)組織的分布位置，。例如，被廣泛用于臨床骨髓移植的 HSC 在骨髓中存在于兩骨細胞外圍，因而血管內(nèi)皮細胞和成骨細胞分別是構(gòu)成這兩部分[113, 116]。
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R782.23

【參考文獻】

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1 杜兆杰;雷德林;王磊;曹健;張雅博;張圃;馬秦;程曉兵;;下頜牽張成骨中應用神經(jīng)生長因子對神經(jīng)損傷修復的作用[J];創(chuàng)傷外科雜志;2010年02期

2 魏奉才;張東;劉少華;孫善珍;;整合素α_Vβ_3在下頜牽張成骨過程中表達的實驗研究[J];華西口腔醫(yī)學雜志;2005年06期

3 白丁,王大章;利用牽張成骨矯治嚴重后牙鎖

本文編號：2685010