【摘要】：背景:牙齒的發(fā)育是由外胚層來(lái)源的上皮細(xì)胞和神經(jīng)嵴來(lái)源的間充質(zhì)細(xì)胞相互作用實(shí)現(xiàn)的。大量的信號(hào)通路及相關(guān)的信號(hào)分子參與調(diào)控牙齒發(fā)育的過(guò)程,比如骨形態(tài)發(fā)生蛋白分子(bone morphogenetic proteins,BMPs)。在目前已分離出來(lái)的14種骨形態(tài)發(fā)生蛋白中,骨形態(tài)發(fā)生蛋9(BMP9),也稱為生長(zhǎng)轉(zhuǎn)化因子2(growth and development 2,GDF2)是誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化能力最強(qiáng)的一種BMP分子,但BMP9在牙齒發(fā)育過(guò)程中的作用尚不清楚。目的:本實(shí)驗(yàn)的目的是探究BMP9信號(hào)在牙齒發(fā)育過(guò)程中的作用并初步探討B(tài)MP9影響牙齒發(fā)育的可能機(jī)制。方法:本實(shí)驗(yàn)第一部分通過(guò)免疫組化染色研究BMP9在小鼠牙胚中的表達(dá)模式。第二部分實(shí)驗(yàn)利用已成功構(gòu)建的BMP9基因敲除小鼠模型通過(guò)大體觀察、micro-CT、三維重建分析以及組織學(xué)分析研究BMP9對(duì)牙-牙槽骨發(fā)育的影響。最后在體外實(shí)驗(yàn)中,利用沉默表達(dá)和過(guò)表達(dá)BMP9的腺病毒感染小鼠根尖牙乳頭干細(xì)胞后進(jìn)行ALP染色、ALP活性分型和qPCR來(lái)觀察對(duì)其成骨、成牙分化能力的影響。結(jié)果:實(shí)驗(yàn)第一部分,通過(guò)對(duì)不同發(fā)育階段的小鼠磨牙牙胚進(jìn)行免疫組化染色,我們發(fā)現(xiàn)BMP9在牙冠和牙根發(fā)育時(shí)期的成牙本質(zhì)細(xì)胞,成釉細(xì)胞,牙髓細(xì)胞,牙槽骨的成骨細(xì)胞中均有表達(dá)。實(shí)驗(yàn)第二部分,通過(guò)大體形態(tài)研究發(fā)現(xiàn)BMP9基因敲除小鼠的牙齒比對(duì)照組野生型小鼠更易磨損,且牙根較短。通過(guò)micro-CT、三維重建和組織學(xué)分析發(fā)現(xiàn)與野生型小鼠相比,BMP9基因敲除小鼠第一磨牙的牙根短,牙本質(zhì)壁薄,根管和根尖孔粗大,這些現(xiàn)象與人類遺傳性疾病--Ⅲ型牙本質(zhì)發(fā)育不全相似。此外,BMP9基因敲除小鼠牙槽嵴變低,牙槽骨骨密度降低,骨體積分?jǐn)?shù)減小。體外實(shí)驗(yàn)證明沉默表達(dá)BMP9可以抑制牙源性干細(xì)胞的成骨分化標(biāo)志物ALP和成牙分化標(biāo)志物牙本質(zhì)涎磷蛋白(Dspp)、牙本質(zhì)基質(zhì)蛋白1(Dmp1)的表達(dá),而過(guò)表達(dá)BMP9則會(huì)促進(jìn)ALP、Dspp和Dmp1的表達(dá)。結(jié)論:BMP9可能在牙齒-牙槽骨復(fù)合體的發(fā)育中有重要作用,但其具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。
【圖文】：

圖 1.1 (A-D)出生后 4,7,11,15 天小鼠下頜第一磨牙的 HE 染色。(A’-D’)A-D 的放大圖像。Od,成牙本質(zhì)細(xì)胞;Am, 成釉細(xì)胞; P, 牙髓細(xì)胞; Os, 成骨細(xì)胞.比例尺：500μm or 50μm。Figure 1.1 (A-D) H & E staining of first mandibular molar in mice at PN4, PN7, PN11 andPN15. (A’-D’) Magnification ofA-D. Od, odontoblasts; Am, ameloblasts; P, dental pulp; Os,osteoblasts. Scale bars: 500 μm or 50 μm.2.2 免疫組化染色結(jié)果根據(jù) H&E 染色的結(jié)果，我們選擇了 PN4,7,11,15 來(lái)代表出生后牙齒發(fā)育的幾個(gè)重要階段以探究 BMP9 在出生后牙胚發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)模式。如圖 1.2 所示，在PN4 時(shí)，BMP9 在成釉細(xì)胞，成牙本質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)。除此之外，BMP9 在牙囊細(xì)胞，，牙髓細(xì)胞，牙槽骨的成骨細(xì)胞，以及牙釉質(zhì)基質(zhì)和前期牙本質(zhì)中均有表達(dá)。在PN7，PN11 和 PN15 時(shí)，BMP9 在牙胚中的表達(dá)模式與 PN4 時(shí)相似。本實(shí)驗(yàn)用 PBS 代替BMP9 一抗作為陰性對(duì)照組。

圖 2.1 BMP9 基因敲除鼠牙齒的大體形態(tài)。（A）BMP9 基因敲除鼠基因構(gòu)建示意圖。(B)BMP9 基因敲除鼠切牙切端明顯磨耗，而對(duì)照組正常小鼠切牙是完整的。白色箭頭指示切牙。 (C) BMP9 基因敲除鼠下頜第一磨牙牙尖明顯磨耗并且牙根比對(duì)照組正常小鼠短。紅色箭頭指示牙尖。Figure 2.1 Gross morphology of teeth in the BMP9-KO mice. (A) Gene targeting strategy forgenerating BMP9-KO mice. (B) Representative images of tooth morphology of the BMP9-KOand wild-type mice. The incisor tip was worn in BMP9-KO mice, which was intact in wild-typecontrol (white arrows). (C) The first mandibular molar from BMP9-KO mutants vs. wild-typelittermates. The BMP9-KO mice displayed smaller molar with shorter roots and obvious worncusps compared with wild-type. Red arrows indicated the molar cusps.2.2 Micro-CT 分析 BMP9 基因敲除鼠和對(duì)照組野生型小鼠牙及牙
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R78

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本文編號(hào)：2685001