【摘要】：牙髓炎是人類口腔的常見病、多發(fā)病之一。目前的治療方法尚未能完全替代牙體組織的功能。組織工程的臨床應(yīng)用為恢復(fù)牙齒活性和功能帶來新的希望。特別是成功分離培養(yǎng)出具有自我更新和多向分化能力的牙髓干細胞（dental pulp stem cells，DPSCs），因其可以形成牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體，故是牙齒組織工程重要的種子細胞。在構(gòu)建組織工程牙齒過程中，除種子細胞和支架材料外，細胞所處的微環(huán)境、細胞間相互作用以及細胞內(nèi)外信號分子的調(diào)控因素等都是影響細胞生長分化進而影響組織工程實現(xiàn)的重要因素。 在牙髓炎性環(huán)境下，炎癥因子和致炎細菌成分均可影響DPSCs的生物學(xué)功能。Toll樣受體4（Toll-like Receptor4，TLR4）作為細菌壁成分脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）的特異性受體，在啟動DPSCs的天然免疫及炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，并且在牙髓炎發(fā)生時，牙髓中革蘭陰性菌釋放的各類毒性產(chǎn)物包括LPS的含量明顯增加。但目前關(guān)于LPS及其受體TLR4影響DPSCs分化作用及機制的研究甚少。 哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）信號通路可以整合生長因子、能量狀態(tài)等相關(guān)信號通路，調(diào)控細胞自噬、生長、免疫、炎癥、凋亡、蛋白合成與能量代謝等，是近年來各學(xué)科研究的熱點領(lǐng)域。目前關(guān)于mTOR在干細胞分化過程中發(fā)揮重要作用的研究已成為學(xué)者們關(guān)注的重點，但是mTOR在細菌毒性炎性刺激的干細胞如LPS刺激的DPSCs中的生物學(xué)機制尚不明確。我們已知牙髓組織炎癥是牙髓病中最主要的疾病，細菌是其重要的致病因素，因此闡明細菌成分脂多糖在DPSCs分化中的調(diào)控作用及其細胞內(nèi)分子機制具有重要的意義。本課題在體外分離、培養(yǎng)和鑒定人DPSCs的基礎(chǔ)上，通過LPS和mTOR的特異性抑制劑雷帕霉素作用于DPSCs研究LPS活化的TLR4信號途徑調(diào)控的人DPSCs分化作用及mTOR對其的影響，以期闡明mTOR信號通路在LPS調(diào)控DPSCs分化中的分子機制，對闡明牙髓損傷修復(fù)時DPSCs分化的分子機制有重要意義，為DPSCs組織工程應(yīng)用和將來臨床活髓保存治療提供新方法和新思路。所取得的主要研究結(jié)果如下： 1、脂多糖受體TLR4和mTOR在人DPSCs分化中的表達及變化 為獲得純化的人DPSCs，我們使用改良酶消化法分離獲得原代人牙髓細胞，利用有限稀釋法克隆培養(yǎng)并通過傳代純化細胞，結(jié)果顯示所培養(yǎng)的DPSCs形態(tài)典型、均一。采用流式細胞儀定量分析牙髓干細胞的Stro-1等表型的陽性表達率，，表明所獲細胞具有間充質(zhì)干細胞屬性；將克隆鑒定的DPSCs分別進行礦化誘導(dǎo)及成脂誘導(dǎo)14天，結(jié)果顯示茜素紅染色陽性的礦化結(jié)節(jié)形成及油紅O染色陽性的脂滴形成，表明DPSCs礦化誘導(dǎo)或成脂誘導(dǎo)后向成牙本質(zhì)樣細胞或成脂樣細胞分化。以上結(jié)果表明：本研究克隆鑒定的DPSCs具有自我更新及多向分化的潛能，具有間充質(zhì)干細胞的特性。從而再次表明DPSCs在牙齒組織工程領(lǐng)域有著廣闊的前景，也為本課題進一步以DPSCs進行的研究奠定了基礎(chǔ)。 為探索DPSCs分化過程中脂多糖受體TLR4和mTOR的表達情況，我們體外普通培養(yǎng)液培養(yǎng)上述克隆鑒定的DPSCs24h，提取RNA，逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）結(jié)果顯示，DPSCs內(nèi)存在TLR4基因和mTOR基因的表達；另外我們礦化誘導(dǎo)DPSCs7天、10天和14天，通過實時定量PCR （Real-time PCR）檢測DPSCs內(nèi)TLR4和mTOR的表達變化，結(jié)果表明在兩周內(nèi)隨時間延長TLR4和mTOR的表達不斷增強，提示TLR4和mTOR信號途徑可能參與DPSCs的分化過程。 2、脂多糖對DPSCs分化過程中TLR4和mTOR表達的影響 為進一步明確TLR4和mTOR是否參與脂多糖調(diào)控的DPSCs分化過程，我們將DPSCs在不同的誘導(dǎo)條件下培養(yǎng)7天、10天和14天。分組情況如下：對照組加礦化誘導(dǎo)液，LPS刺激組為含終末濃度為1μg/mL LPS的礦化誘導(dǎo)液。Real-time PCR結(jié)果顯示LPS刺激組的TLR4mRNA和mTOR mRNA表達明顯高于對照，并且隨時間延長LPS刺激組的TLR4和mTOR表達均增高，以上結(jié)果提示TLR4和mTOR信號均可能參與脂多糖調(diào)控的DPSCs分化過程。 3、mTOR在脂多糖調(diào)控的DPSCs分化中的作用 為更好的理解脂多糖LPS對DPSCs調(diào)控的作用及mTOR在其中的作用機制，我們通過含各種刺激的礦化液分別誘導(dǎo)DPSCs7天、10天、14天，對照組加礦化誘導(dǎo)液，實驗組LPS組加含終末濃度為1μg/mL LPS的礦化誘導(dǎo)液，實驗組Rapa+LPS組加含1μM Rapa和1μg/mL LPS的礦化誘導(dǎo)液。通過ALP染色和茜素紅染色結(jié)果顯示，LPS組的ALP活性和礦化結(jié)節(jié)明顯高于對照，而Rapa+LPS組則明顯弱于LPS組。Real-time PCR結(jié)果顯示Rapa+LPS組的DSPP、BSP、OCN基因的表達明顯低于LPS組。而LPS組的DSPP表達明顯高于對照組；在10d、14d時LPS組的BSP基因表達也明顯高于對照；但是OCN基因的表達在7d時LPS組明顯高于對照組，在14d時LPS組的OCN表達低于對照組。 同時我們通過含各種刺激的礦化液分別誘導(dǎo)DPSCs21天，掃描電鏡結(jié)果和茜素紅定量法結(jié)果顯示，LPS組能夠形成細胞外礦化基質(zhì)小球并且鈣含量明顯高于對照，但Rapa+LPS組顯示雷帕霉素抑制LPS誘導(dǎo)的礦化基質(zhì)小球形成和鈣含量。以上結(jié)果表明在一定時間內(nèi)，一定濃度的LPS可以誘導(dǎo)DPSCs的分化能力，雷帕霉素則抑制LPS調(diào)控的分化作用，從而間接證實mTOR可能參與LPS調(diào)控的DPSCs分化作用。 綜上所述，本研究認為LPS活化的TLR4信號途徑可以誘導(dǎo)DPSCs的分化能力，mTOR可能在LPS誘導(dǎo)的DPSCs分化中發(fā)揮重要作用，這對闡明牙髓損傷修復(fù)時DPSCs分化的分子機制有重要意義，為DPSCs組織工程應(yīng)用提供新的思路，也為將來臨床活髓保存治療提供新的方法。
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R781.31

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 劉培光,周道斌,沈悌;人骨髓間充質(zhì)干細胞的鑒定:抗SH2和SH3單克隆抗體的制備與應(yīng)用[J];中國實驗血液學(xué)雜志;2005年04期

2 張琛;侯本祥;李玉晶;張敏;;脂多糖信號受體CD14、TLR4在人牙髓組織和牙髓成纖維細胞中的表達[J];中華口腔醫(yī)學(xué)雜志;2006年06期

本文編號：2682045