【摘要】： 牙胚發(fā)育早期是牙齒定位與定型的重要階段。大量研究表明,牙胚發(fā)育的起動(dòng)期決定牙胚形成的位置;帽狀期決定牙胚發(fā)育的類型,多種生物因子在上皮-間充質(zhì)間發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。蛋白質(zhì)組學(xué)是一門主要研究蛋白質(zhì)組的組成成份及生物學(xué)功能的新興學(xué)科,從而可以在蛋白水平綜合分析影響牙齒發(fā)育的調(diào)控機(jī)制。因此,本實(shí)驗(yàn)通過激光捕獲顯微分離技術(shù)分別獲取小鼠牙胚發(fā)育早期(起動(dòng)期E11.5天和帽狀期E15.5天)的下頜磨牙間充質(zhì)細(xì)胞,采用雙向電泳、多級(jí)質(zhì)譜和數(shù)據(jù)庫查詢的蛋白質(zhì)組研究方案,分析小鼠磨牙牙胚發(fā)育早期間充質(zhì)細(xì)胞所含蛋白質(zhì)在數(shù)量、種類上的變化,進(jìn)一步探討影響牙齒發(fā)育的調(diào)控因素,以期尋找和發(fā)現(xiàn)新的關(guān)鍵因子,從而為牙胚發(fā)育研究提供一種新的思路。 目的:1.熟練掌握小鼠牙胚發(fā)育起始期、蕾狀期、帽狀期、鐘狀期冰凍切片的制備方法;2.熟練掌握激光捕獲顯微切割技術(shù),并捕獲足夠量的細(xì)胞樣本(E11.5天及E15.5天下頜磨牙間充質(zhì)細(xì)胞);3.獲得兩組細(xì)胞的蛋白質(zhì)雙向凝膠電泳圖譜,鑒定差異蛋白點(diǎn),探討兩個(gè)時(shí)期影響牙胚發(fā)育的分子機(jī)制。 方法:1.獲得準(zhǔn)確發(fā)育天數(shù)的C57胎鼠,制備小鼠下頜磨牙牙胚發(fā)育各期的冰凍切片;2.使用PixCell IIe激光捕獲顯微切割系統(tǒng)對冰凍切片上發(fā)育各期的間充質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行分離,收集細(xì)胞樣本至需要量;3.采用第一向等電聚焦電泳、第二向十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳、硝酸銀染色獲得兩組細(xì)胞樣本的雙向電泳圖,圖像分析軟件比較差異蛋白點(diǎn)4.利用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀獲得差異蛋白點(diǎn)的一級(jí)、二級(jí)質(zhì)譜圖,以及蛋白氨基酸序列,通過蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫檢索并結(jié)合差異蛋白質(zhì)點(diǎn)的分子信息進(jìn)行綜合分析,鑒定差異蛋白。 結(jié)果:1.獲得E11.5、12.5、13.5、14.5、15.5、16.5、17.5天小鼠下頜磨牙牙胚冰凍切片;2.經(jīng)激光捕獲得到需要量的兩組(E11.5牙胚起動(dòng)期、E15.5牙胚帽狀期)下頜磨牙間充質(zhì)細(xì)胞;3.兩組細(xì)胞雙向電泳圖獲得20個(gè)差異蛋白點(diǎn),其中15個(gè)點(diǎn)得到鑒定。質(zhì)譜結(jié)果顯示:E11.5組細(xì)胞新增蛋白為膜聯(lián)蛋白A2、肌動(dòng)蛋白β、丙酮酸激酶M;E11.5組細(xì)胞上調(diào)蛋白為ATP合成酶d亞單位、ATP合成酶α亞單位、轉(zhuǎn)酮酶、β烯醇酶;E15.5組細(xì)胞新增蛋白為真核翻譯延長因子2、乳酸脫氫酶B、M-Septin;E15.5組細(xì)胞上調(diào)蛋白為真核翻譯延長因子1γ、核內(nèi)核糖核蛋白H2、核內(nèi)核糖核蛋白X、乳酸脫氫酶A、絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酯酶1γ。 結(jié)論:1.通過陰栓觀察及胎鼠身長測量相結(jié)合的方法,提高了胎齡判斷的準(zhǔn)確性和小鼠的利用率;2.經(jīng)過對發(fā)育各階段胎鼠頭部進(jìn)行連續(xù)冰凍切片,明確下頜磨牙牙胚的具體位置,大大提高了獲得牙胚冰凍切片的效率;3.通過激光捕獲顯微切割技術(shù)成功獲得目的細(xì)胞;4.通過差異蛋白點(diǎn)的鑒定及分析,獲得的蛋白主要為細(xì)胞糖代謝及能量代謝相關(guān)蛋白酶、參與蛋白翻譯合成、以及參與某些信號(hào)傳導(dǎo)途徑的信號(hào)分子等,這些蛋白分別在小鼠下頜磨牙牙胚發(fā)育起動(dòng)期和帽狀期間充質(zhì)細(xì)胞中存在特異性表達(dá)或表達(dá)上調(diào),為進(jìn)一步研究牙胚早期發(fā)育的調(diào)控機(jī)制提供了新的線索。
【圖文】：

不同天數(shù)胎鼠的大體形態(tài)觀察（e~h）

E11.5天間充質(zhì)細(xì)胞雙向電泳圖
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2008
【分類號(hào)】：R78

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本文編號(hào)：2679869