【摘要】：齲病是口腔常見病、多發(fā)病。當(dāng)齲壞到達(dá)牙本質(zhì)后,致齲菌和/或其毒性產(chǎn)物可以通過牙本質(zhì)小管進(jìn)入牙髓腔,導(dǎo)致牙髓炎癥。免疫反應(yīng)和第三期牙本質(zhì)是牙髓發(fā)揮防御和修復(fù)能力的主要方式。成牙本質(zhì)細(xì)胞由于具有長(zhǎng)的細(xì)胞突起深入到牙本質(zhì)小管,是牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體最先接觸細(xì)菌微生物的細(xì)胞,那么成牙本質(zhì)細(xì)胞是否和口腔粘膜上皮細(xì)胞一樣,具有天然免疫的功能,多年來未見研究報(bào)道。TLR9是特異識(shí)別包含未甲基化CpG基序的細(xì)菌DNA(CpG DNA)的天然免疫受體,在許多組織細(xì)胞均可快速激活天然免疫反應(yīng),并啟動(dòng)后續(xù)的適應(yīng)性免疫反應(yīng),在組織細(xì)胞免疫防御反應(yīng)中發(fā)揮重要的作用,目前在抗感染、抗過敏和抗腫瘤治療中已取得了很大的研究進(jìn)展。本課題組發(fā)現(xiàn)體外培養(yǎng)的成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞表達(dá)TLR9,提示TLR9可能介導(dǎo)成牙本質(zhì)細(xì)胞的天然免疫功能。但是對(duì)于體內(nèi)的成牙本質(zhì)細(xì)胞是否表達(dá)TLR9、TLR9是否特異識(shí)別細(xì)菌DNA、TLR9活化后細(xì)胞內(nèi)信號(hào)途徑以及下游基因表達(dá)情況國(guó)內(nèi)外尚未見報(bào)道。 面對(duì)細(xì)菌入侵,除了免疫反應(yīng),形成第三期牙本質(zhì)是牙髓發(fā)揮防御和修復(fù)能力的另一種主要方式。許多研究證實(shí)DSPP基因表達(dá)產(chǎn)物在牙本質(zhì)形成和礦化,以及第三期牙本質(zhì)形成過程中均發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用。由于在細(xì)菌感染導(dǎo)致成牙本質(zhì)細(xì)胞或成牙本質(zhì)細(xì)胞樣細(xì)胞形成第三期牙本質(zhì)的過程中伴隨DSPP基因表達(dá),那么成牙本質(zhì)細(xì)胞內(nèi)TLR9信號(hào)途徑在被細(xì)菌DNA活化后是否調(diào)控DSPP基因表達(dá)國(guó)內(nèi)外尚未見研究報(bào)道。 綜上所述本實(shí)驗(yàn)通過分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法對(duì)TLR9、DSPP基因進(jìn)行研究,旨在闡明TLR9介導(dǎo)成牙本質(zhì)細(xì)胞天然免疫反應(yīng)和調(diào)控DSPP基因表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)途徑。探討齲病進(jìn)展過程中,細(xì)菌DNA感染、成牙本質(zhì)細(xì)胞免疫反應(yīng)、DSPP基因表達(dá)與第三期牙本質(zhì)形成相互之間的聯(lián)系,對(duì)闡明牙髓病病因、牙髓損傷修復(fù)的分子機(jī)制和DSPP基因表達(dá)調(diào)控規(guī)律有重要意義,為免疫防齲研究和活髓保存治療提供新的思路和途徑。 1 TLR9、DSPP在成牙本質(zhì)細(xì)胞和牙髓組織中的表達(dá) 首先收集小鼠牙髓組織利用組織塊抽提RNA方法提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄,行PCR擴(kuò)增觀察TLR9 mRNA在牙髓組織中的表達(dá);其次從小鼠OLC成牙本質(zhì)細(xì)胞系中提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄,行PCR擴(kuò)增觀察TLR9 mRNA、DSPP mRNA的表達(dá)。1%瓊脂糖凝膠電泳顯TLR9 mRNA在小鼠牙髓組織中和OLC細(xì)胞系中均有顯著表達(dá),DSPP mRNA在OLC細(xì)胞系中有顯著表達(dá)。TLR9 mRNA分子量198bp,DSPP mRNA分子量151bp。 2 CpG DNA對(duì)OLC細(xì)胞內(nèi)TLR9、DSPP基因表達(dá)調(diào)控 6孔板培養(yǎng)OLC細(xì)胞,用CpG ODN-A和CpG ODN-B刺激細(xì)胞,設(shè)置時(shí)間梯度為0、3、6、9、12、24小時(shí)。提取總RNA,反轉(zhuǎn)錄,行PCR擴(kuò)增和實(shí)時(shí)定量PCR以觀察TLR9 mRNA、DSPP mRNA的表達(dá)量變化。1%瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果和實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示CpG ODN-A刺激組中TLR9 mRNA、DSPP mRNA表達(dá)量無明顯變化。CpG ODN-B刺激組中TLR9 mRNA、DSPP mRNA表達(dá)量呈現(xiàn)先升高后降低的變化,6小時(shí)表達(dá)量最高,且6小時(shí)組是0小時(shí)組的3倍。 3參與CpG OND調(diào)控DSPP基因的表達(dá)的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)途徑 三種細(xì)胞信號(hào)途徑抑制劑:ERK信號(hào)途徑抑制劑,PD98059;p38信號(hào)途徑抑制劑,SB203580;NF-κB信號(hào)途徑抑制劑,PDTC。OLC細(xì)胞經(jīng)以上三種抑制劑(濃度為30μmol/L)作用后,加入CpG ODN-B刺激6小時(shí)后提取總RNA,實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示ERK和NF-κB組DSPP mRNA表達(dá)明顯降低;p38組中DSPP mRNA表達(dá)量無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
【圖文】：

圖 1 OLC 細(xì)胞系培養(yǎng)胞總RNA的提取 細(xì)胞長(zhǎng)滿 25ml 培養(yǎng)瓶中，PBS 洗滌細(xì)胞 2 次，參書操作。方法參照 1.2.3照 1.2.4R反應(yīng)照 1.2.5物凝膠電泳物各取 4μl，以 DL2000 Maker 為參照，進(jìn)行 1%瓊45min，用凝膠成像分析系統(tǒng)拍照分析 TLR

圖 2 TRL9、DSPP 在成牙本質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)和 TLR9 在牙論TLR9作為識(shí)別細(xì)菌DNA細(xì)胞膜上的免疫受體，在機(jī)活產(chǎn)生免疫應(yīng)答，從而使得機(jī)體產(chǎn)生天然免疫反應(yīng)。1032個(gè)氨基酸編碼，兩者之間有77%的一致行，，人類號(hào)染色體（3p2113）[53]。TLR9基因與MyD88基因相連接方式表達(dá)，一種是單外顯（monoexonic），另一種是基因全長(zhǎng)約5kb，共兩個(gè)外顯子，其中第二外顯子是thern印記表明，TLR9表達(dá)于富含免疫細(xì)胞的組織如脾，而在外周血單核細(xì)胞中，主要表達(dá)TLR9的細(xì)胞是胞（plasmacytiod dendritic cells，PDC）和B細(xì)胞[55]。達(dá)目前研究未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)中TLR9在小鼠牙髓組
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2010
【分類號(hào)】：R781.1

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 張瑩;人牙本質(zhì)涎蛋白的基因克隆、表達(dá)和功能研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2002年

本文編號(hào)：2675761