【摘要】：牙周炎是人類最常見的慢性感染性疾病。局限性侵襲性牙周炎（localized aggressive periodontitis，LAP），發(fā)展迅速，具有侵襲性，是牙周損害特別嚴(yán)重的感染性疾病，主要發(fā)生在青春期，如果不經(jīng)治療，可以很快的造成牙周組織毀壞，局部牙槽骨吸收，牙齒缺失，主要發(fā)生在切牙和第一恒磨牙。它是一種細(xì)菌感染性疾病，現(xiàn)在主要致病菌已經(jīng)確定為放線共生放線桿菌(Actinobacillus actinomycetemcomitans,簡稱A.a)。A.a除可導(dǎo)致牙周炎外，還可引起各種類型膿腫、肺炎、敗血癥、骨髓炎、尿路感染等疾病，特別應(yīng)引起注意的是，A.a在引起牙周炎的基礎(chǔ)上，可引起傳染性亞急性細(xì)菌性心內(nèi)膜炎。牙周炎的治療目前主要分為機(jī)械治療和藥物治療，效果不十分理想。利用相應(yīng)抗體治療牙周炎是目前牙周病治療研究的一個(gè)熱點(diǎn)。A.a造成牙周組織損壞的致病機(jī)理還不十分清楚，但是它可以產(chǎn)生多種毒力因子，導(dǎo)致牙周組織損害。而粘附是細(xì)菌產(chǎn)生毒力作用的首要步驟，菌毛粘附到牙齦組織上是其致病的關(guān)鍵，干擾細(xì)菌的粘附可以預(yù)防牙周病的發(fā)生。因此，針對(duì)菌毛的高效價(jià)的抗體可以預(yù)防牙周病的發(fā)生；同時(shí)，因?yàn)锳.a粘附到組織后，還可以脫落下來，所以抗體通過拮抗作用，對(duì)牙周炎也起到治療作用。研究表明，A.a菌毛是由多個(gè)菌毛蛋白亞單位fap（fimbrial associated protein也稱flp-1）構(gòu)成的，分子量大約為65KD，其中主要菌毛亞單位是一段起粘附作用的保守性抗原蛋白，其編碼基因?yàn)?28bp，無致病作用，具有較強(qiáng)的誘導(dǎo)抗體產(chǎn)生的能力。有研究者體外化學(xué)合成一個(gè)fap與其它蛋白的偶聯(lián)蛋 WP=100 白，并用它免疫動(dòng)物，獲得的抗體有抑制A.a粘附的作用，從而達(dá)到預(yù)防和治療牙周病的目的。由于它編碼的蛋白分子量小，抗原性較差，所以需要偶連上一段蛋白，增大它的分子量，以增大它的免疫原性。大腸桿菌不耐熱毒素（LT）是某些大腸桿菌在生長、繁殖過程中產(chǎn)生并釋放出來的一種外毒素，可導(dǎo)致人或幼畜腹瀉。它具有很強(qiáng)的誘導(dǎo)粘膜免疫反應(yīng)的功能，能使機(jī)體對(duì)與其共同服用的抗原分子產(chǎn)生較強(qiáng)的粘膜免疫反應(yīng)；LTB誘導(dǎo)的粘膜免疫反應(yīng)類型為TH1/TH2型，既可以同時(shí)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫反應(yīng)和細(xì)胞免疫反應(yīng)。國外有研究人員利用Ltb與其它蛋白基因重組，表達(dá)出重組蛋白，免疫動(dòng)物后證明Ltb可以明顯的增強(qiáng)機(jī)體對(duì)其偶連蛋白的體液和粘膜免疫反應(yīng)。而口腔恰好是粘膜免疫發(fā)生作用的重要部位�；谏鲜稣J(rèn)識(shí)，我們?cè)O(shè)計(jì)利用fap作為抗原組分，以期利用它刺激機(jī)體產(chǎn)生抑制A.a粘附的抗體；利用Ltb增強(qiáng)其免疫反應(yīng)。并通過Linker與fap連接起來構(gòu)成融合基因，增加其免疫應(yīng)答，同時(shí)由于LTB可以刺激機(jī)體產(chǎn)生針對(duì)大腸桿菌不耐熱性腸毒素的抗體，所以它也可以作為二價(jià)疫苗，對(duì)由大腸桿菌不耐熱性腸毒素所引起的腹瀉起一定的預(yù)防作用。本研究有主要以下四方面內(nèi)容：1從含有LT全毒素基因操縱子的質(zhì)粒EWD299中擴(kuò)增出LT的B亞單位基因后，定向克隆于原核表達(dá)載體pET28a中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）plyss，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，將全菌裂解，用SDS-PAGE和Western-blot檢測重組菌中外源蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果表明，在原核細(xì)胞中高效表達(dá)了LTB蛋白，表達(dá)的重組蛋白占菌體蛋白總量的38%。2從含有LT全毒素基因操縱子的質(zhì)粒EWD299中擴(kuò)增出LT的B亞單位基因toxB，從放線共生放線桿菌中擴(kuò)增出菌毛蛋白亞單位蛋白的基因fap，用PCR的方法將二基因通過Linker連接起來，而后定向克隆于原核表達(dá)載體pET28a中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）plyss，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后，將全菌裂解，用SDS-PAGE和Western-blot檢測重組菌中外源蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果表明，在原核細(xì)胞中表達(dá)了融合蛋白LTB-(Gly4Ser)2-FAP，表達(dá)的重組蛋白占菌體蛋白總量的15%。3將重組質(zhì)粒pET/LTB和pET/LTB-FAP分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，通過超聲裂解獲得了以包涵體形式表達(dá)的外源蛋白；確定了洗滌和溶解包涵體的最佳尿素濃度；用陰離子交換和凝膠過濾柱層析的方法對(duì)重組蛋白LTB-FAP進(jìn)行了純 WP=101 化，獲得了純度可達(dá)90%的包涵體蛋白。4為了證明A.a310菌毛亞單位基因重組融合蛋白LTB-FAP可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高效價(jià)的抗菌毛抗體，抑制A.a菌的粘附能力。我們利用純化的LTB-FAP免疫新西蘭大白兔，通過間接ELISA技術(shù)檢測其抗體效價(jià)，并用獲得的抗LTB-FAP血清進(jìn)行免疫抑制試驗(yàn)。我們獲得了高效價(jià)的抗LTB-FAP血清，建立了間接ELISA檢測抗體效價(jià)的方法，抗LTB-FAP血清可以顯著的抑制A.a310對(duì)頰粘膜上皮細(xì)胞的粘附。A.a310菌毛亞單位基因重組融合蛋白可以有效的誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體抑制A.a菌的粘附。本研究在國內(nèi)外首次構(gòu)建了pETLTB-FAP載體,成功的得到了表達(dá)，，并進(jìn)行了抗A.a粘附的研究，證明LTB-FAP可以刺激機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)抑制A.a菌的粘附。這對(duì)下一步研究LTB-FAP刺激機(jī)體產(chǎn)生粘膜免疫反應(yīng)、對(duì)牙周病的防治、LAP疫苗的研究具有重要意義。
【圖文】：

條件的優(yōu)化 分別以 0.2mM、 0.6mM、1.0mM、1. IPTG 誘導(dǎo)的重組菌 4hr 后，行 SDS-PPAGE 檢測表圖 5，圖中顯示，重組蛋白存在于包涵體中，其表達(dá)原核細(xì)胞中表達(dá)的 SDS-PAGE 結(jié)果yss（pET28a/LTB）；2.BL21（DE3）；3 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn) （97 000, 66000,20 000,14 400）tion of the recombinant proteinrom prokaryocyte on SDS-PAGE,1ss（pET28a/LTB）,2.BL21（DE3）,3 Marker圖 4 重組蛋白印跡檢測plyss（pET28a/LTB）；plyss（pET-28a）Fig4 Western-blot ofprotein LTB expresseplyss（pET28a/LTB）1（pET28a/LTB） 2. B（pET-28a）

條件的優(yōu)化 分別以 0.2mM、 0.6mM、1.0mM、1. IPTG 誘導(dǎo)的重組菌 4hr 后，行 SDS-PPAGE 檢測表圖 5，圖中顯示，重組蛋白存在于包涵體中，其表達(dá)原核細(xì)胞中表達(dá)的 SDS-PAGE 結(jié)果yss（pET28a/LTB）；2.BL21（DE3）；3 蛋白分子量標(biāo)準(zhǔn) （97 000, 66000,20 000,14 400）tion of the recombinant proteinrom prokaryocyte on SDS-PAGE,1ss（pET28a/LTB）,2.BL21（DE3）,3 Marker圖 4 重組蛋白印跡檢測plyss（pET28a/LTB）；plyss（pET-28a）Fig4 Western-blot ofprotein LTB expresseplyss（pET28a/LTB）1（pET28a/LTB） 2. B（pET-28a）
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2004
【分類號(hào)】：R781.4

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 方向東,林來興妹,高基民,黃樹其,馬驪,周峻嶺,王小宇;重組人G-CSF大腸桿菌表達(dá)產(chǎn)物的純化及鑒定[J];中國生物制品學(xué)雜志;1997年01期

2 郭學(xué)軍,朱平;大腸桿菌不耐熱腸毒素突變體LTR72基因的克隆及序列分析[J];中國獸醫(yī)學(xué)報(bào);2001年06期

本文編號(hào)：2674519