發(fā)布時間：2020-05-20 09:59

【摘要】：背景:周圍神經(jīng)缺損在神經(jīng)科學(xué)中的常見病,其修復(fù)是臨床治療的難點。近年來,應(yīng)用組織工程技術(shù),在體外架構(gòu)具有良好生物相容性的支架材料用于修復(fù)周圍神經(jīng)的損傷已經(jīng)成為研究熱點。將神經(jīng)修復(fù)支架應(yīng)用于被橋接神經(jīng)的兩斷端,可以引導(dǎo)軸突的軸向生長,避免神經(jīng)瘤的形成,并為神經(jīng)再生提供相對孤立的微環(huán)境。本研究旨在使用Myroilysin酶制備一種新的脫細(xì)胞異種神經(jīng)支架,并在支架上復(fù)合具有神經(jīng)分化潛能的兔牙髓前體細(xì)胞,從而獲取一種可以促進缺損區(qū)域周圍神經(jīng)修復(fù)和再生的牙髓前體細(xì)胞-脫細(xì)胞異種神經(jīng)復(fù)合物神經(jīng)組織工程復(fù)合物。第一部分Myr o i I ys i n 酶法脫細(xì)胞異種神經(jīng)支架的制備與組織結(jié)構(gòu)觀察以及機械性能評價目的:應(yīng)用Myroilysin酶法制作脫細(xì)胞異種神經(jīng)支架,并對支架進行組織結(jié)構(gòu)觀察和機械力學(xué)評估。方法:獲得Wistar大鼠的坐骨神經(jīng)后,分別用Myroilysin酶和Sondell化學(xué)方法對坐骨神經(jīng)進行脫細(xì)胞處理。大體觀察脫細(xì)胞處理后的神經(jīng)支架并制作組織切片,光學(xué)顯微鏡下觀察HE染色和Masson染色后的支架的脫細(xì)胞效果及神經(jīng)基底膜和膠原結(jié)構(gòu)。通過掃描電子顯微鏡觀察神經(jīng)支架的表面物理性質(zhì)。應(yīng)用Wintest力學(xué)測試軟件評估支架的一系列機械力學(xué)性能指標(biāo),如極限載荷、彈性模量、韌度、極限應(yīng)力、極限應(yīng)變、斷裂功耗等。結(jié)果:與Sondell化學(xué)處理的神經(jīng)相比,用Myroilysin酶法處理的神經(jīng)呈現(xiàn)出顯著的膨脹現(xiàn)象。組織學(xué)觀察可見兩種脫細(xì)胞神經(jīng)支架的軸突,細(xì)胞,髓鞘結(jié)構(gòu)消失,膠原纖維排列均勻有序,神經(jīng)基底膜呈波浪狀排布。掃描電子顯微鏡顯示,Myroilysin酶法獲得的脫細(xì)胞神經(jīng)支架的孔隙和有序排列模式與天然神經(jīng)更為相似,縱形溝壑狀結(jié)構(gòu)更明顯。Wintest力學(xué)分析表明,Myroilysin酶法脫細(xì)胞神經(jīng)支架的機械力學(xué)性能指標(biāo)與天然神經(jīng)相比無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。結(jié)論:Myroilysin酶法與sondell化學(xué)法脫細(xì)胞效果相似,利用Myroilysin酶法制備神經(jīng)支架對神經(jīng)支架機械力學(xué)影響小,滿足支架植入的力學(xué)要求,是值得考慮的一種神經(jīng)支架材料。第二部分兔牙髓前體細(xì)胞的體外培養(yǎng)鑒定和神經(jīng)方向誘導(dǎo)分化目的:體外培養(yǎng)鑒定牙髓前體細(xì)胞,并對獲得的細(xì)胞進行神經(jīng)方向誘導(dǎo)分化。方法:獲取三月齡純系新西蘭大白兔健康牙髓組織以及12-15歲患者中因正畸需要 除的健康前磨牙牙髓組織。應(yīng)用Gronthos酶消化法對牙髓組織進行原代培養(yǎng),對獲得人牙髓前體細(xì)胞進行流式細(xì)胞術(shù)檢測鑒定間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記物和神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記物。對獲得的兔牙髓前體細(xì)胞進行神經(jīng)方向誘導(dǎo)并對誘導(dǎo)前后的細(xì)胞進行免疫熒光染色,并進行相關(guān)間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)記物和神經(jīng)細(xì)胞標(biāo)記物qRT-PCR及 Western blotting 檢測。結(jié)果:體外培養(yǎng)獲得了能夠高度增殖的細(xì)胞,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測人牙髓前體細(xì)胞為 CD29+,CD106+,CD44+,CD73+,CD90+/CD34-,CD45-,CD271-,CD133-,CD31-,免疫熒光結(jié)果顯示培養(yǎng)的兔牙髓前體細(xì)胞中存在GFAP,MBP,P75和S-100陽性的細(xì)胞。兔牙髓前體細(xì)胞神經(jīng)方向誘導(dǎo)后獲得的類神經(jīng)細(xì)胞免疫熒光結(jié)果顯示 GFAP,MBP,P75,S-100 陽性,qRT-PCR 及 Western blotting結(jié)果顯示神經(jīng)表面標(biāo)記GFAP和MBP表達(dá)增加。結(jié)論:在本研究中體外培養(yǎng)獲得的細(xì)胞中存在牙髓前體細(xì)胞,將牙髓前體細(xì)胞神經(jīng)方向誘導(dǎo)后可以得到神經(jīng)表面標(biāo)記物陽性和分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子的類神經(jīng)細(xì)胞;在牙髓前體細(xì)胞中存在功能與神經(jīng)細(xì)胞相似的細(xì)胞,可以考慮將GFAP,MBP,P75,S-100陽性的牙髓前體細(xì)胞應(yīng)用于牙髓前體細(xì)胞-脫細(xì)胞異種神經(jīng)組織工程神經(jīng)移植復(fù)合物。第三部分Myro i I ys i n酶法脫細(xì)胞異種神經(jīng)支架的體內(nèi)和體外生物學(xué)性能評估目的:評估脫細(xì)胞異種神經(jīng)支架的膠原穩(wěn)定性和體內(nèi)外生物相容性,將牙髓前體細(xì)胞復(fù)合在Myroilysin酶法及Sondell化學(xué)法脫細(xì)胞異種神經(jīng)支架,探討脫細(xì)胞異種神經(jīng)支架的體內(nèi)和體外生物學(xué)性能。方法:應(yīng)用I型膠原酶酶解天然神經(jīng),Myroilysin酶法脫細(xì)胞神經(jīng)支架和Sondell化學(xué)法脫細(xì)胞神經(jīng)支架,比較三者的降解情況,從而評估其膠原穩(wěn)定性。制備支架提取液,并將兔牙髓前體細(xì)胞與提取液體外共培養(yǎng),通過流式細(xì)胞增殖與凋亡檢測和CCK-8細(xì)胞增殖試驗評估支架的體外細(xì)胞相容性。將兔牙髓前體細(xì)胞植入到Myroilysin酶法和Sondell化學(xué)法脫細(xì)胞異種神經(jīng)支架中,通過EdU試驗觀察支架上有無增殖期細(xì)胞以及細(xì)胞的排列分布。使用與支架浸提液共培養(yǎng)的兔牙髓前體細(xì)胞,通過qRT-PCR及Western blotting分析支架浸提液對牙髓前體細(xì)胞在mRNA和蛋白水平上表達(dá)神經(jīng)表面標(biāo)記物及神經(jīng)營養(yǎng)因子的影響。將復(fù)合兔牙髓前體細(xì)胞和脫細(xì)胞異種神經(jīng)的神經(jīng)移植物植入三月齡純系新西蘭大白兔坐骨神經(jīng)缺損模型內(nèi),分別于30天,90天后分析兔坐骨神經(jīng)缺損模型移植后坐骨神經(jīng)及其支配骨骼肌恢復(fù)情況。結(jié)果:Myroilysin酶法和Sondell化學(xué)法脫細(xì)胞神經(jīng)支架的降解速率與天然神經(jīng)基本一致;將兔牙髓前體細(xì)胞與脫細(xì)胞神經(jīng)浸提液共培養(yǎng)后,Myroilysin酶法脫細(xì)胞異種神經(jīng)浸提液的細(xì)胞增殖活性高于單獨培養(yǎng)和Sondell組,表現(xiàn)出良好的細(xì)胞相容性,但Sondell組細(xì)胞增殖速度明顯下降,表現(xiàn)出對細(xì)胞明顯的毒性;Myroilysin酶法脫細(xì)胞異種神經(jīng)支架可使兔牙髓前體細(xì)胞粘附其上并呈現(xiàn)較為明顯的方向性生長方式,但在Sondell組支架上并沒有發(fā)現(xiàn)增殖細(xì)胞,并且細(xì)胞分布散亂。用Myroilysin酶法脫細(xì)胞異種神經(jīng)支架浸提液培養(yǎng)兔牙髓前體細(xì)胞后,細(xì)胞的神經(jīng)表面標(biāo)記物MBP和S-1 00在mRNA水平和蛋白水平出現(xiàn)上調(diào),betaⅢ Tubulin,CD90,NeuN和神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNF及NGF在mRNA水平出現(xiàn)了上調(diào)。將復(fù)合兔牙髓前體細(xì)胞和脫細(xì)胞異種神經(jīng)的神經(jīng)移植物植入三月齡純系新西蘭大白兔坐骨神經(jīng)缺損模型內(nèi)后,30天后EdU檢測見Myroilysin復(fù)合牙髓前體細(xì)胞組S-100陽性增殖期細(xì)胞增加,CD31陽性增殖期細(xì)胞深入支架內(nèi)部,90天后Myroilysin復(fù)合牙髓前體細(xì)胞組復(fù)合動作電位幅度和神經(jīng)傳導(dǎo)速度與自體神經(jīng)移植對照組差異減小(P0.05),肌濕重恢復(fù)率無明顯差異(P0.05)。結(jié)論:在本研究中Myroilysin酶法脫細(xì)胞異種神經(jīng)支架具有與天然神經(jīng)類似的體外降解率,體外和動物體內(nèi)細(xì)胞相容性良好,可誘導(dǎo)牙髓前體細(xì)胞向神經(jīng)細(xì)胞方向的分化。其多孔縱向溝壑狀結(jié)構(gòu)和保存完好的周圍神經(jīng)細(xì)胞外基質(zhì)成分可使牙髓前體細(xì)胞粘附生長在支架上。將兔牙髓前體細(xì)胞-Myroilysin酶法脫細(xì)胞異種神經(jīng)移植復(fù)合物植入三月齡純系新西蘭大白兔坐骨神經(jīng)缺損模型后,修復(fù)效果接近自體神經(jīng)移植。牙髓前體細(xì)胞-Myroilysin酶法脫細(xì)胞異種神經(jīng)神經(jīng)組織工程復(fù)合物可以成為修復(fù)周圍神經(jīng)缺損的神經(jīng)移植物新選擇。
【圖文】：

Ａ取材；Ｂ為Ｓｏｎｄｅｌｌ化學(xué)法（左為天然神經(jīng)，右為脫細(xì)胞神經(jīng)）；Ｃ為逡逑Ｍｙｒｏｉｌｙｓｉｒｉ酶法（左為天然神經(jīng)，右為脫細(xì)胞神經(jīng)）；Ｄ，Ｇ，Ｊ：為天然神經(jīng)逡逑ＨＥ和Ｍａｓｓｏｎ染色（放大倍數(shù)為２００Ｘ），掃描電鏡觀察（放大倍數(shù)為２０Ｘ）；逡逑Ｅ，，Ｈ，Ｋ：為化學(xué)法處理的神經(jīng)ＨＥ和Ｍａｓｓｏｎ染色（放大倍數(shù)為２００Ｘ），掃描電逡逑鏡觀察（放大倍數(shù)為２０Ｘ）邋；邋Ｆ，邋Ｉ，Ｌ：為Ｍｙｒｏｉｌｙｓｉｎ酶法處理的神經(jīng)ＨＥ和逡逑Ｍａｓｓｏｎ染色（放大倍數(shù)為２００Ｘ），掃描電鏡觀察（放大倍數(shù)為２０Ｘ）逡逑７３逡逑

圖５邋Ｒｅａｌ－ｔｉｍｅ邋ｑＲＴ－ＰＣＲ及Ｗｅｓｔｅｒｎ邋Ｂｌｏｔ．檢測兔牙髓前體細(xì)胞神經(jīng)方向誘導(dǎo)前后逡逑神經(jīng)相關(guān)標(biāo)記基因及蛋白的表達(dá)逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R783.6

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本文編號：2672445